1、一、凝结芽孢杆菌,1、分类地位 2、用途意义 3、培养基 4、培养条件 5、技术关键,1、分类地位,1、凝结芽孢杆菌是乳酸菌的一种。 2、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)呈杆状，两端钝圆，革兰氏阳性菌，过氧化氢酶阳性，芽胞端生，无鞭毛。 3、最适生长温度为4550，最适pH 值为6.67.0。其能分解糖类生成L- 乳酸，为同型乳酸发酵菌。 4、凝结芽孢杆菌除具有和乳酸菌及双歧杆菌同样的保健功效外，还具有耐酸、耐热、耐盐、容易培养和保存的特点,5、菌株在YPD 培养基上生长良好, 48 h 形成直径23 mm 大小的圆形菌落, 白色而有光泽, 表面湿润、平坦, 边缘整齐。油镜
2、观察, 菌体形态为杆状, 单个、成对或链状排列, 芽胞端生。,6、凝结芽孢杆菌经90，60min 湿热处理和120，60min 干热处理，其活菌数只下降了一个数量级；将其置于pH 值大于2.42 的酸性溶液中，存放一年后，其存活率仍高达105；凝结芽孢杆菌在1%7% NaCl 溶液中均可存活4 周以上，其在8% NaCl 溶液中能存活一个月。但凝结芽孢杆菌在低pH 值条件下，其抗逆性会下降。例如在酸性条件下(pH4.0)，凝结芽孢杆菌孢子对热几乎没有耐受性，而且生长受到抑制。此外，Cerrutti 等也发现在pH 值小于4.5 和水活度0.96 条件下，凝结芽孢杆菌的生长受到抑制。,2、用途意
3、义,1、对胃肠道炎症有一定治疗作用。 2、调节动物消化道的微生态平衡。 3、促进动物机体的消化作用。 4、改善动物机体免疫功能, 提高抗病能力。 5、促进动物生长、降低死亡淘汰率和饲料增重比。 6、人体保健作用包括：提高消化道对膳食纤维的有效利用率，防止脂肪分子的过度吸收（降脂作用）；减少患冠心病的危险；抗便秘；预防沙门氏菌、轮状病毒、副溶血弧菌等致病微生物引起的腹泻。,3、培养基,1、分离培养基（MRS 培养基）：胰蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、柠檬酸二铵2 g、乙酸钠5 g、酵母粉5 g、葡萄糖5 g、磷酸二氢钾2 g、吐温80 1.0 ml、碳酸钙20 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0
4、.25 g、水1 000 ml, 调pH 值6.26.5, 115 灭菌20 min。 改良MRS 培养基: 在MRS 培养基基础上添加-甲基葡萄糖苷10 g、山梨酸钾1 g, 调pH 值6.26.5,115 灭菌20 min。,2、凝结芽孢杆菌增殖培养基(YPD 培养基) : 葡萄糖20 g、胰蛋白胨20 g、酵母粉10 g、水1 000 ml, 调pH值7.0, 115 灭菌20 min。 3、固体培养基: 在液体培养基的基础上添加1.5%的琼脂。 4、种子培养基(W/ V) : 蛋白胨10 g/L, 酵母浸出物5 g/ L, 氯化钠10 g/ L, 固体培养基再加琼脂15 g/ L, 自
5、然pH。 5、基础发酵培养基(W/ V) : 蔗糖10 g/L, 蛋白胨10 g/ L, 磷酸氢二钠2 g/ L, 磷酸二氢钠2 g/ L,pH 7. 0。,4、培养条件,1、分离纯化：将药片粉碎加入到10ml无菌试管中，加入灭菌的蒸馏水，震荡摇匀，静置。取上清2ml加入到改良MRS 培养基中,37 静置培养。然后从每个样品取2 ml, 80 水浴5 min 后取0.1 ml转接乳酸菌增殖培养基固体平板, 37 培养。待菌落长出,随机挑取菌落,纯化,编号并保存。,2、接斜面：将分离的菌种转接到种子斜面培养基, 40 培养24 h, 备用。 3、种子液的制备：取一环活化的菌种, 接入装液量为50
6、 mL YPD液体培养基的250 mL 三角瓶中, 40 , 180 r/min,培养18 h。 4、摇瓶培养：分别取1 mL( 接种量为2% , V/ V) 种子液,接入盛有50 mL 培养基的250 mL 三角瓶中。置摇床中, 30 振荡培养12 h, 转速为160 r/ min。,实验条件优化,5、优化后的培养基配方为：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏2g/L，MnSO40.005g/L，NaCl 2g/L，K2HPO4 3g/L，MgSO4 0.02g/L，在此培养基基础上进行发酵条件的优化，得出优化后的培养条件为：温度40，初始pH值为7.0，转速210r/min，装液量为30
7、mL（250mL的三角瓶），接种量为6%（v/v），发酵时间48h。,6、益生凝结芽孢杆菌AHU1366 的液体深层发酵培养 发酵培养基的组成为：麸皮4 %、豆粕粉1. 5 %、NaCl 0. 5%、K2HPO4 4%、MnSO4 30.8mg/ L, pH 7. 2 7. 4。 最佳发酵条件为：250 mL 三角瓶中装液体积为15 mL, 接种量4 % , 37 , 180 r/ min, 摇瓶培养56 h,在优化后的培养条件下, 生物量OD600达到19. 68, 芽孢形成率为80 % 。,5、技术关键,1、结芽孢杆菌为兼性厌氧菌，好氧厌氧条件下不影响生长，但由于芽孢是在营养缺乏的条件下产
8、生的，所以若要考虑芽孢量的多少，通气量还是不可少的条件。 2、试验从装液量和转速方面来研究，最终的结果是当转速为210r/min、装液量为30mL（250mL三角瓶）时产芽孢量最多。 3、对于培养温度，过低导致菌的生长缓慢，不利于芽孢形成，过高的温度下菌自溶得快，还没来得及产芽孢就自溶了，也不利于芽孢的形成，最适产孢温度为40。,4、凝结芽孢杆菌在培养过程中会产乳酸，使得菌液的pH值降低，所以要求发酵液的初始pH值不能太低，但如果pH值太高，又不利于菌的生长，得不到较多的芽孢，所以本试验设计的初始pH值为6.57.5。 5、芽胞形成率依赖于细胞密度，在菌体浓度达到1010cfu/mL的过滤培养
9、中，芽胞形成率上升至60%。在摇瓶条件下，添加由相同菌株发酵液制备而来的条件培养基可以促进芽胞的形成，芽胞形成率为62.5%以上，,6、碳源是影响芽孢形成的重要因素，高浓度碳源会抑制芽孢的形成。 7、无机盐在调控芽孢形成中发挥重要作用。Mn2+ 对芽孢的形成起到显著作用，当浓度在0.005%0.1% 范围内，对芽孢的形成有促进作用，当浓度大于0.10% 时，对菌体生长有抑制作用。PO4 3-也有利于芽孢的形成，而K+ 和Na+ 对凝结芽孢杆菌芽孢的形成无明显促进作用，无机盐的作用遵循“适量促进、过量抑制”的原则。 8、王进华等研究发现高温对芽胞的形成有明显影响。50条件下芽胞的形成率可以达到57.7%，而且减少通气量有助于芽胞的形成。 9、王天云等则在培养细胞后期加入固体介质可以促进芽孢的形成，例如木屑、碎布屑和玉米芯。而且芽孢形成率达9 5% 以上，通常在添加后静置培养48h 后芽孢就可以形成。,
