1、1.菌 种 特 点 ：米曲霉( Asp.oryzae) 属于真菌 菌落生长快，10d 直径达 56cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径 150300m，也有少数为疏松柱状。分生孢子梗 2mm 左右。近顶囊处直径可达 1225m ，壁薄，粗糙。顶囊近球形或烧瓶形，通常 4050m。上覆小梗， 小梗一般为单层，1215m，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形或近球形，一般 4.5 m，粗糙或近于光滑。 （ 半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种） 。菌落生长较快，质地疏松。初
2、呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业产品霉变。米曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会 1989 年公布的 40 余种安全微生物菌种之一。 米 曲 霉米 曲 霉 是 一 类 产 复 合 酶 的 菌 株 ， 除 产 蛋 白 酶 外 ， 还 可 产 淀 粉 酶 、 糖 化
3、 酶 、 纤 维 素 酶 、植 酸 酶 等 。 在 淀 粉 酶 的 作 用 下 ， 将 原 料 中 的 直 链 、 支 链 淀 粉 降 解 为 糊 精 及 各 种 低 分 子糖 类 ， 如 麦 芽 糖 、 葡 萄 糖 等 ； 在 蛋 白 酶 的 作 用 下 ， 将 不 易 消 化 的 大 分 子 蛋 白 质 降 解 为蛋 白 胨 、 多 肽 及 各 种 氨 基 酸 ， 而 且 可 以 使 辅 料 中 粗 纤 维 、 植 酸 等 难 吸 收 的 物 质 降 解 ，提 高 营 养 价 值 、 保 健 功 效 和 消 化 率 ， 广 泛 应 用 于 食 品 、 饲 料 、 生 产 曲 酸 、 酿 酒
4、 等 发酵 工 业 ， 并 已 被 安 全 地 应 用 了 1000 多 年 。 米 曲 霉 是 理 想 的 生 产 大 肠 杆 菌 不 能 表 达 的真 核 生 物 活 性 蛋 白 的 载 体 。 米 曲 霉 基 因 组 所 包 含 的 信 息 可 以 用 来 寻 找 最 适 合 米 曲 霉 发酵 的 条 件 ， 这 将 有 助 于 提 高 食 品 酿 造 业 的 生 产 效 率 和 产 品 质 量 。 米 曲 霉 基 因 组 的 破译 ， 也 为 研 究 由 曲 霉 属 真 菌 引 起 的 曲 霉 病 提 供 了 线 索 。 曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,
5、能产生酸性、中性和碱性蛋白酶 ,其稳定性高 ,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。1.1 影响米曲霉系的因素 影响米曲霉酶系形成、作用的因素主要有：1曲料：曲料米曲霉的菌丝由多细胞组成，具有产酶功能，菌丝体在曲料上生长好坏直接关系到其酶系的形成和酶活性的强弱。酱油制曲过程的实质就是要创造米曲霉生长的最适宜条件，保证米曲霉充分发育繁殖，分泌出酿造酱油所需的各种酶类。所以制曲原料的选择、处理和配比要严格把关。曲料要以蛋白质含量较高、碳水化合物适量为原则进行选择配比。曲料的处理要注意以下几点：1。粉碎要适度。颗粒太粗，会减少米曲霉生长繁殖的总面积，降低酶活力；颗粒太细，润水后容易
6、结块，蒸料时会产生夹心，导致制曲通风不畅，不利于米曲霉的生长。2。蒸煮要适度。控制蛋白质的适度变性，蛋白质的变性过程对米曲霉生长极其重要。. 2温度酱油发酵的过程就是各种酶促反应的过程，温度越高，酶促反应越快，发酵周期越短。然而，酶的化学本质是蛋白质，它具有蛋白质的结构和特性，一般在低温时就开始受到破坏，并随着温度的升高，酶受到的破坏程度变大。3 PH 值：PH 对酶的影响主要有：（1）影响酶的稳定性；（2）影响酶与底物的结合以及酶催化底物转化成产物。在一定的条件下，各种酶都有其特定的最适 PH 值。偏离这个值，酶的活性都会降低，甚至会引起酶蛋白质的变性而失去活性。4食盐：食盐对酶促反应的影响
7、在酱油发酵过程中，添加适量的食盐能够有效地抑制一些有害微生物的生长和繁殖，对酱培起着防腐作用。食盐对蛋白酶活性的影响：低质量浓度的食盐对蛋白酶有激活作用，反之对蛋白酶产生抑制作用，所以发酵状态对酶促反应的影响采用低盐固态发酵工艺，由于酱醅内部粘性大、流动性差，保温时底部和周壁的温度较高，酶的失活加速，很不利于酶作用的发挥1.2 酱油生产中的米曲霉：酱油酿造过程主要依赖于米曲霉所产生的丰富的蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多种酶系,未分解原料中的多种成分,从而形成酱油独特的色、香、味、体。培养米曲霉菌种挑选原料煮豆-制曲发酵压榨配置酱油罐装检测生产过程中需用到米曲霉的是制曲和发酵，制曲的目的是使米曲霉在曲
8、料上充分生长发育，并大量产生和积蓄所需要的酶，如蛋白酶、肽酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。在发酵过程中味的形成是利用这些酶的作用。如蛋白酶及肽酶将蛋白质水解为氨基酸，产生鲜味；谷氨酰胺酶把万分中无味的谷氨酰胺变成具有鲜味的俗谷氨酸；淀粉酶将淀份水解成糖，产生甜味；果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶等能将细胞壁完全破裂，使蛋白酶和淀粉酶水解等更彻底。制成的酱曲移入发酵池或发酵罐，再加盐水发酵。发酵是一个生物转化过程,通过温度和时间,让米曲霉分泌多种酶,其中是蛋白酶和淀粉酶、蛋白酶分解蛋白质为氨基酸,淀粉酶把淀粉分解成葡萄糖。2.米曲霉发酵产物的应用2.1 米曲霉发酵产各种酶制剂
9、2.1.1 发酵产蛋白酶及应用米曲霉在食品酿造方面的应用历史悠久,近些年在饲料加工方面的研究也日趋深入,这些方面的研究主要集中在米曲霉发酵产蛋白酶方面上。最近有文献报道,米曲霉发酵产蛋白酶可以水解鳕鱼粉制备蛋白胨。蛋白胨广泛应用于食品、发酵、医药、卫生、临床细菌检验及科研等方面。可见蛋白酶在产品深加工领域也将会创造更大效益。2.1.2 发酵产淀粉酶及应用淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称,包括 -淀粉酶、- 淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。淀粉酶是一种诱导酶,这类酶的形成只有在底物存在时才能生成,其作用是将淀粉或糖浆中残留的淀粉进一步彻底降解为单糖即葡萄糖、果糖等。单糖对产品的色、香、味、体都
10、有重要影响。2.1.3 发酵产 -半乳糖苷酶及应用-半乳糖苷酶可消除乳糖不耐症,米曲霉所代谢出的 - 半乳糖苷酶能够水解牛乳和乳清中的乳糖,成为可以吸收和甜味品质好的半乳糖和葡萄糖。同时又能合成低聚半乳糖,此糖是双岐杆菌增值因子,难以被人体消化,能改善便秘,具降低血糖,促进钙的吸收,抗龋齿等作用6。2.1.4 发酵产脂肪酶及应用脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一,可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应,将脂肪分解成脂肪酸和甘油并广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。王小花7等人对米曲霉产胞外脂肪酶培养条件进行优化 ,筛选出麦芽糖为最佳碳源,蛋白胨为
11、最佳氮源,平高级脂肪醇与环氧乙烷加成物为最佳的表面活性剂,为米曲霉产脂肪酶方向的研究提供了参考。2.1.5 发酵产纤维素酶及应用纤维素酶系一般包括三种水解酶,即内切葡聚糖酶(Cx)、外切葡聚糖酶(C1) 、-葡萄糖苷酶(G)。纤维素酶在食品、饲料、农副产品加工、石油开采和资源再利用等方面具有广泛应用前景。黄晓东8等人利用豆渣对米曲霉进行固态发酵得出 :提取物的抗氧化性增强。经分析验证,米曲霉代谢所产生的 -葡萄糖苷酶( G ) 使豆渣中异黄酮糖苷酶酶解为异黄酮苷元。异黄酮苷元具有很强的抗氧化性。2.1.6 发酵产果胶酶及应用果胶酶是分解果胶的酶的通称,也是一个多酶复合物。果胶酶主要是由果胶裂解
12、酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶酸盐裂解酶和果胶酯酶组成。果胶酶可以降低果汁的粘度、澄清果汁、提高果汁超滤通量、提高葡萄酒得率及过滤速度,其应用对食品加工业做出了很大贡献。汤鸣强9等对米曲霉固体发酵生产果胶酶进行研究,得出米曲霉菌株 F-81 发酵条件及浸提条件。2.1.7 发酵产氨基酰化酶及应用氨基酰化酶是一类能专一水解 N-乙酰-DL-氨基酸的酰胺键的酶,由于这种立体专一性,所以很早就被用来拆分 DL-氨基酸。L-型、D-型氨基。2.1.8 发酵产植酸酶及应用目前植酸酶在饲料添加剂市场需求很广。可以提高禽肉、禽蛋的氮、磷、钙利用率。陈惠11等人对微生物产植酸酶的条件及热稳定性进行研究,对比了黑曲霉
13、 9701、米曲霉9712、根霉 9702 三种霉菌的固体培养法生产植酸酶的条件。由文献是对比研究,所以要单向研究米曲霉,可参考此法进行深入研究。2.1.9 发酵产大豆异黄酮糖苷酶及应用大豆异黄酮以游离甙元和结合型的糖苷形式存在,前者生理活性很好,后者必须转化为甙元的形式才能更好的被吸收。大豆异黄酮有抗肿瘤作用,尤其是对与激素有关的肿瘤,如乳腺癌和前列腺癌有显著抑制作用,另外对治疗和预防心脑血管疾病有很好的疗效。但大多数大豆异黄酮都是以结合型糖苷形式存在,所以用米曲发酵产分解糖苷的酶的研究具有社会意义和经济效益。曾莹12等人研究并优化了米曲霉高产大豆异黄酮糖苷酶发酵条件 ,为这一领域的研究实践
14、做出了贡献。2.1.10 发酵产腺苷酸脱氨酶及应用腺苷酸(AMP)脱氨酶是一种氨基水解酶,它能够定量脱去腺苷酸嘌呤碱基上的氨基,生成肌苷酸(IMP)和 NH3。IMP 可用于生产药品和强力味精。AMP 脱氨酶是构成嘌呤核苷酸代谢循环的 3 种主要酶类之一,它对维持体内腺苷酸能荷和机体免疫力有重要作用。此外,它还是核酸酶解法生产呈味核苷酸(钠盐是新一代的核苷酸类食品鲜味增强剂) 的重要酶类之一。国内虽在 20 世纪 80 和 90 年代对曲霉 AMP 脱氨酶进行了研究,但目前尚未工业化生产。段作营13等人通过实验获得了米曲霉 3.800 固态发酵产腺苷酸 (AMP)脱氨酶的适宜培养基并对组成进行
15、了优化,确定了麸曲中 AMP 脱氨酶的浸提条件,对其进行了初步纯化,为将来工业化生产提供依据。2.1.11 发酵产 SI 核酸酶及应用SI 核酸酶(SI nuclease)是从米曲霉中分离纯化的一种金属蛋白,分子量为 32kDa,是一种耐热的酶(3765 ) 。可用于分析 DNA:RNA 杂交体的结构,去掉双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端,打开双链 cDNA 合成中产生的发荚环。Vogt14等人于 1973 年对米曲霉产的 SI核酸酶进行了纯化和进一步的性质研究,至今相关的资料并不多见。2.1.12 发酵产复合酶及应用2.1.12.1 米曲霉菌丝体可以催化药物合成3,4-二羟苯 L-丙氨酸
16、是一种药物,它不仅可以选择性的调节因神经鞘受损后心肌膜能量代谢所产酶的的水平,而且还可以治疗帕金森病。米曲霉 UV-7 可产酪氨酸羟化酶、酪氨酸酶和-酪氨酸酶,这三种酶可以催化 L-酪氨酸合成 3,4-二羟苯 L-丙氨酸,这一微生物学转变为生化领域通往药物域又开辟一条新径15。2.1.12.2 米曲霉催化甘油生产 1,3-丙二醇1,3-丙二醇(1,3-PDO) 是一种重要的化工原料,是有机合成的中间体,主要用作聚酯和聚氨酯的单体,以及溶剂、分析试剂、抗冻剂和保护剂等。苑广志16等人采用以甘油为唯一碳源和以甘油与葡萄糖共同作碳源的方法从米曲霉菌 AS3042 和 UV-48 出发,筛选到两株催化
17、甘油生产 1,3-丙二醇的霉菌。生物催化法生产化工原料具有节能、环保、高效等特点,成为人们研究热点,也为进一步产业化打下基础。2.2 米曲霉发酵产有机酸的研究与应用2.2.1 发酵产曲酸曲酸是一种具有抗菌作用的有机酸,对水果、蔬菜有护色作用,还可以消除人体内自由基,同时具有抑制黑色素生成酶活性的能力,还可用作摄影、胶片去斑剂等,因此在食品、化妆品、农业、医药、化工等行业有着广阔的应用前景。董静17等人研究了复合诱变对米曲霉 2336产酸量的影响,经过紫外线、60Co 诱变筛选出 1 株不产黄曲霉毒素且高产曲酸、能利用玉米淀粉为碳源的变异株。2.2.2 发酵产圆弧偶氮酸圆弧偶氮酸是一种神经毒。赵
18、珊18等人利用反相高效液相色谱法分析米曲霉发酵液中的圆弧偶氮酸。该方法为米曲霉代谢产物研究开辟新径。30 总第 350 期 中国调味品霉作为牲畜的益生素益生素是一种含有大量有益菌及其代谢产物和生长促进因子的活菌制剂,它能维持肠道微生物平衡、提高机体健康水平。1994 年我国批准了 6 种益生菌菌株可以使用,其中包括米曲霉(其余 5 种为芽孢杆菌、乳酸杆菌、粪链球菌、酵母菌和黑曲霉) 。米曲霉及其提取物对牲畜、家禽的消化功能、生产功能都有很大影响。孙安权19等人研究了米曲霉提取物对瘤胃生态及奶牛生产性能的影响。瘤胃是反刍动物的一种特殊的消化器官,在消化过程中起到很重要的作用。此项研究表明,米曲霉
19、发酵提取物艾美福(Amaferm)通过刺激纤维素分解菌的生长,提高纤维素酶的产量,提高饲草中纤维的消化率,改善反刍动物瘤胃生理功能,稳定瘤胃 pH 值,从而达到降低奶牛代谢疾病,提高反刍动物的生产性能及体况,显著提高奶牛抗热应激的能力。Han 等人(1999)通过对产蛋鸡饲喂米曲霉益生素的实验得出结论: 不能排除外源性米曲霉在胃肠道中与内源性菌群有协同互作的作用。Grimes 等(1997)进行了一项试验,以测定米曲霉和黑曲霉的发酵产物 Fermacto“福美多“对产蛋母鸡的功效。Fermacto 是我国农业部批准进口美国培一埃公司生产的益生素饲料添加剂。试验结果表明,向产蛋母鸡日粮中添加 0
20、.1%的米曲霉益生素可以影响营养元素消化、调节胆固醇代谢及肠道菌群,并减少氨气的产生。3 研究结果以米曲霉 A-29 菌株为出发菌株，进行发酵培养和产酶菌株的筛选。研究结果表明，米曲霉 A-29 在豆米粉 7.5%、 （NH4）2SO40.8%、水 40%、KH2PO40.25%、麸皮 51.45%的固体培养基上产酸性蛋白酶活力最高，发酵温度为 30，最适发酵时间为 72。酸性蛋白酶是一种适合在酸性条件下水解蛋白质为小肽和氨基酸的酶类。酸性蛋白酶的条件：(1） 、pH 值适应性 酸性蛋白酶作用的最适稳定 pH 范围在 2.04.0 之间，最适 pH3.0，低于 2.0，高于 4.0 将影响水解
21、速度。曲霉属一般在 3.0 以下。（2） 、温度适应性 酸性蛋白酶一般在 50以下可保持稳定，曲霉属所产的酶在 50仍稳定，但在 55处理 10 分钟就失活。（3） 、金属离子对酶活力地影响 酸性蛋白酶可被 Mn2、Ca2+、Mg2+离子激活，被Cu2+、Hg2+、Al2+离子抑制，液体酸性蛋白酶，长时间存放碳钢罐中将失活较多。4.材料及仪器4.1 材料和试剂培养基：1. 麦芽汁斜面培养基：取已制备好的麦芽汁，调糖度为 8%，加 2%琼脂，PH 自然，融化后分装试管，121，高温蒸汽灭菌 20 分钟，制成斜面培养基。2. 优化出的酸性蛋白酶最佳正交培养基：豆米粉 7.5%、 （NH4 ）2SO
22、40.8%、水40%、KH2PO40.25%、麸皮 51.45%。菌种：米曲霉 A-29,保存菌株的培养基为麦芽汁斜面培养基。4.2 发酵方法1. 菌株的转接将米曲霉 A-29 在无菌操作条件下使用接种环接入斜面培养基中，并置于恒温培养箱中29培养 96h，使之全部孢子化后取出备用。2. 固态发酵培养在 500ml 三角瓶中装入固体发酵培养基，玻璃棒搅匀后，121下灭菌 20 分钟，冷却后在超净工作台上将转忠后的菌株孢子接入装有固态培养基的三角瓶中，每个培养基接23 环孢子，混匀。然后置于恒温培养箱中 29培养 72h.2.3 分析方法1. 酶的提取称取发酵后的培养物 2.0g，用 80ml
23、缓冲液在研钵中捣碎充分溶解，然后将混合液经滤纸过滤，取滤液 5ml 加蒸馏水定容至 100ml，既得稀释 800 倍的待测酶液。2.酸性蛋白酶酶活的测定a.先将酪素液放入 400.2恒温水浴中预热 5 分钟b.测定：在试样管中，取经 400.2预热 2 分钟的稀释酶液 1.0ml，加入预热的 10g/l 酪素溶液1.0ml，于 400.2保温 10 分钟，立即加入 0.4mol/l 的三氯乙酸溶液 2.0ml 以终止反应。在空白对照管中，取经 400.2预热 2 分钟的稀释酶液 1.0ml，先加入 0.4mol/l 的三氯乙酸溶液 2.0ml，于 400.2保温 10 分钟，再加入预热的 10
24、g/l 酪素溶液 1.0ml。将上述的试样管和空白对照管取出静止 10 分钟后过滤，取 1.0ml 滤液，加入 0.4mol/l 碳酸钠溶液 5.0ml，再加福林试剂 1.0ml，400.2水浴中显色 20 分钟取出，冷却后在 680nm 处测定吸光度。4.3 酸性蛋白酶酶活的计算酸性蛋白酶酶活的定义：1g 固体发酵产物，在乳酸缓冲液中，于 40的条件下，一分钟分解酪蛋白产生一微克的酪氨酸称为一个酶活单位，以 U/g 表示。计算公式：X=AKv/tn=2/5AKnX:样品酶活力 A：样品平行实验平均吸光度 K：吸光常数 v：反应体积（本实验v=4） t=反应时间（本实验 t=10）n：稀释倍数
25、注：平行误差不超过 3%，并且本实验中如果没有特殊说明，菌体的重量都是指发酵后的菌体湿重。4.4 结果与讨论通过查阅相关资料发现，麸皮、豆饼粉以及微量的无机盐是米曲霉产酸性蛋白酶培养基所必需的，因此选取 3 个配方，进行固态发酵培养，以考查米曲霉 A-29 菌株的生长性能以及产酸性蛋白酶能力。 麸皮 48%，豆饼粉 49.9%,磷酸二氢钾 0.10%，硫酸铵 2%，固体：水=10:9 麸皮 73%，豆饼粉 24.7%,磷酸二氢钾 0.30%，硫酸铵 2%，固体：水=10:9 麸皮 78%，豆饼粉 19.8%，磷酸二氢钾 0.20%，硫酸铵 2%，固体：水=10:9研究结果表明，米曲霉 A-29
26、 菌株在号培养基上生长缓慢，且菌株的孢子化程度不高，产酶水平较低；号培养基菌株生长情况与号相似但菌株总量较大，酶活力水平提高不大；号培养基的菌株生长情况良好，菌株孢子化程度较好，酶酶活力水平很高。因此以号培养基为基础，设设计正交试验。4.5 a.米曲霉 A-29 固态发酵培养基优化在基础培养基中，选取豆饼粉（A） 、 （NH4 ）2SO4（B） 、KH2PO4（C） 、水（D）等4 个因素，按表所示的因素水平进行正交实验，实验设计及结果如下：培养基配比正交实验设计与结果 /%序号 A B C D 酸性蛋白酶活1 6.75 0.6 0 40 12963.062 6.75 0.8 0.125 50
27、 13863.723 6.75 1.0 0.25 60 12577.064 7.50 0.6 0.125 60 14571.385 7.50 0.8 0.25 40 17273.366 7.50 1.0 0 50 13735.067 8.25 0.6 0.25 50 13445.568 8.25 0.8 0 60 12416.239 8.25 1.0 0.125 40 12609.23由表可见，实验组 5 的酸性蛋白酶酶活有最大值 17273.36u/g，实验组 8 的酸性蛋白酶酶活有最小值 12416.23u/g,实验组 4 的蛋白酶酶活达到 14571.38 u/g，其他组合酸性蛋白酶酶活
28、均几乎在 1300014000 u/g 之间。A B C DX1 13134.61 13660.00 13038.12 14281.88X2 15193.27 14517.77 13681.44 13681.45X3 12823.67 12973.78 14431.99 13188.22R 2369.60 1543.99 1393.87 1093.66经比较极差 R,可见 RARBRCRD，即实验所设定的因素中，豆饼粉对米曲霉产蛋白酶水平的影响大，水的影响最小。得到酸性蛋白酶生产最佳因素组合为序号 5，即最适培养及配比（%）为：豆饼粉 7.5、 （NH4）2SO40.8、水 40、KH2PO4
29、0.25 、麸皮 51.45。豆饼粉对米曲霉 A-29 产酸性蛋白酶的影响 经数据分析，酸性蛋白酶的酶活水平随着培养基中豆饼粉的增加呈“钟”型分布,当豆饼粉量过低或过高时都不利于酸性蛋白酶的生产。（NH4） 2SO4 对米曲霉 A-29 产酸性蛋白酶的影响（NH4） 2SO4 可作为发酵中的无机氮源，经分析发现，浓度在 2 时，最适酸性蛋白酶的生产。其原因可能是由于浓度过高会使培养基的 pH 太低，而浓度过低则不能保证菌株正常的氮源需求所致。KH2PO4 对米曲霉 A-29 产酸性蛋白酶的影响根据有关文献的报道，磷酸盐对蛋白酶的生产很重要，它具有稳定蛋白酶的功能。分析表可知，磷酸盐在 0.25
30、%时，即水平 3 时最适合酸性蛋白酶的生产。这一结果也再次证明磷酸盐具有稳定蛋白酶的功能。水量对米曲霉 A-29 产酸性蛋白酶的影响固体发酵的特点在于，它是在培养基呈固态，虽然含水丰富，但没有或几乎没有自由流动水的状态下进行的一种或多种微生物发酵过程。随着培养基中水量的增加，米曲霉的产酶水平是呈逐渐降低的趋势，可见该发酵过程过量水的加入将对酸性蛋白酶的产生有一定抑制作用。这也许主要是因为随着水的加入，固态发酵培养基在发酵过程中更容易结块，培养基紧密度的增加，将使米曲霉生长时的透气性较低，对米曲霉的生长造成了抑制，因而影响产酶能力。b. 米曲霉 A-29 固态发酵工艺优化培养时间的影响考察米曲霉
31、 A-29 在 29分别培养 2484h 米曲霉产酸性蛋白酶的情况，其产酶结果如表所示，可看出 29下进行发酵，随着时间的增长，酸性蛋白酶的生产呈现直线增加趋势，但在 72h 达到最大值，最大值为 17337.69U/g，超过 72h 后发酵产物的酶活逐渐下降。这主要是由于米曲霉 A-29 在产酸性蛋白酶的同时，酸性蛋白酶也在失去活性，当发酵所产生的酶与同时被分解失活的酶量差值最大时，所测酶活将出现最大值，即 72h 时。当超过72h 后，由于菌体的孢子化程度加强，产酸性蛋白酶的能力相应降低，但酸性蛋白酶的分解率没有发生变化，因而其酸性蛋白酶酶活逐渐降低。时间/h 1 2 3 4 平均吸光度平
32、均酶活/u.g-124 0.115 0.152 0.143 0.123 0.133 4278.1336 0.258 0.305 0.266 0.224 0.263 8459.7648 0.371 0.326 0.325 0.328 0.338 10872.2460 0.508 0.442 0.432 0.504 0.472 15182.5472 0.561 0.524 0.552 0.517 0.539 17337.6984 0.474 0.487 0.478 0.502 0.485 15600.7002000400060008000100001200014000160001800020000
33、1 2 3 4 5 6系 列 1系 列 2系 列 3系 列 4系 列 5系 列 6系 列 7培养温度的影响由图可知，30下培养的产物的酸性蛋白酶酶活最高，27下培养的产物的酶活与 33下培养的产物的酶活大致相同。因此，米曲霉 A-29 的最佳培养温度是 30。27时温度低蛋白酶的失活速率小，但同时菌体的生长性能也受到了抑制。33时温度高，使酸性蛋白酶失活速率加快，其酶活也不会太高。30时菌体孢子化较慢，且酸性蛋白失活速率也相对较缓慢，酸性蛋白酶的酶活就很高，因此菌株在 30时出现产酶最高峰。温度/ 1 2 3 4 平均吸光度平均酶活/u.g-127 0.513 0.483 0.414 0.47
34、4 0.471 15150.3730 0.561 0.524 0.552 0.517 0.539 17337.6933 0.508 0.442 0.432 0.504 0.472 15182.54020004000600080001000012000140001600018000200001 2 3系 列 1系 列 2总结：通过正交试验方法，优化得到了米曲霉 A-29 菌株产酸性蛋白酶的最佳发酵培养基（）为：豆饼粉 7.5、 （NH4）2SO40.8、水 40、KH2PO40.25、麸皮 51.45。通过培养基优化实验得出：较佳固态发酵时间 为：72 时。较佳培养温度：30.1.化 学 成 分
35、 米 曲 霉基 本 信 息Aspergillus oryzae ( Asp.oryzae） 半 知 菌 亚 门 ， 丝 孢 纲 ， 丝 孢 目 ， 从 梗 孢 科 ， 曲 霉 属 真 菌 中 的 一 个 常 见 种 。 结 构 介 绍米 曲 霉 菌 落 生 长 快 ， 10d 直 径 达 56cm， 质 地 疏 松 ， 初 白 色 、 黄 色 ， 后 变 为 褐 色至 淡 绿 褐 色 。 背 面 无 色 。 分 生 孢 子 头 放 射 状 ， 一 直 径 150300 m， 也 有 少 数 为 疏 松柱 状 。 分 生 孢 子 梗 2mm 左 右 。 近 顶 囊 处 直 径 可 达 1225
36、m， 壁 薄 ， 粗 糙 。 顶 囊 近 球形 或 烧 瓶 形 ， 通 常 4050 米 曲 霉 m。 小 梗 一 般 为 单 层 ， 1215 m， 偶 尔 有 双 层 ， 也 有 单 、 双 层 小 梗 同 时 存 在 于 一 个 顶囊 上 。 分 生 孢 子 幼 时 洋 梨 形 或 卵 圆 形 ， 老 后 大 多 变 为 球 形 或 近 球 形 ， 一 般 4.5 m，粗 糙 或 近 于 光 滑 。 分 生 孢 子 梗 长 约 2mm， 近 顶 囊 处 直 径 达 12 25 m， 壁 薄 而 精 糙 。顶 囊 近 球 形 或 烧 瓶 形 ， 直 径 40 50 m， 上 覆 单 层 小
37、 梗 。 分 生 孢 子 幼 时 洋 梨 形 或 随 圆形 ， 成 熟 后 为 球 形 或 近 球 形 ， 直 径 4.5 7.0 m， 表 面 粗 糙 或 近 于 光 滑 。 分 生 孢 子 头直 径 150 300 m。 菌 落 生 长 较 快 ， 质 地 疏 松 。 初 呈 白 色 、 黄 色 ， 后 转 黄 褐 色 至 淡 绿褐 色 ， 背 面 无 色 ， 分 布 甚 广 ， 主 要 在 粮 食 、 发 酵 食 品 、 腐 败 有 机 物 和 土 壤 等 处 。 是我 国 传 统 酿 造 食 品 酱 和 酱 油 的 生 产 菌 种 。 也 可 生 产 淀 粉 酶 、 蛋 白 酶 、 果
38、 胶 酶 和 曲 酸等 。 会 引 起 粮 食 等 工 农 业 产 品 霉 变 。 在 生 产 上 的 作 用米 曲 霉 是 一 类 产 复 合 酶 的 菌 株 ， 除 产 蛋 白 酶 外 ， 还 可 产 淀 粉 酶 、 糖 化 酶 、 纤 维素 酶 、 植 酸 酶 等 。 在 淀 粉 酶 的 作 用 下 ， 将 原 料 中 的 直 链 、 支 链 淀 粉 降 解 为 糊 精 及 各 种低 分 子 糖 类 ， 如 麦 芽 糖 、 葡 萄 糖 等 ； 在 蛋 白 酶 的 作 用 下 ， 将 不 易 消 化 的 大 分 子 蛋 白 质降 解 为 蛋 白 胨 、 多 肽 及 各 种 氨 基 酸 ，
39、而 且 可 以 使 辅 料 中 粗 纤 维 、 植 酸 等 难 吸 收 的 物 质降 解 ， 提 高 营 养 价 值 、 保 健 功 效 和 消 化 率 ， 广 泛 应 用 于 食 品 、 饲 料 、 生 产 曲 酸 、 酿酒 等 发 酵 工 业 ， 并 已 被 安 全 地 应 用 了 1000 多 年 。 米 曲 霉 是 理 想 的 生 产 大 肠 杆 菌 不 能表 达 的 真 核 生 物 活 性 蛋 白 的 载 体 。 米 曲 霉 基 因 组 所 包 含 的 信 息 可 以 用 来 寻 找 最 适 合 米曲 霉 发 酵 的 条 件 ， 这 将 有 助 于 提 高 食 品 酿 造 业 的 生
40、 产 效 率 和 产 品 质 量 。 米 曲 霉 基 因组 的 破 译 ， 也 为 研 究 由 曲 霉 属 真 菌 引 起 的 曲 霉 病 提 供 了 线 索 。 米 曲 霉 的 培 养 固 态 培 养 方 法 （ solid state cultivation ） ： 主 要 有 散 曲 法 和 块 曲 法 。 部 分黄 酒 用 曲 ， 红 酒 及 酱 油 米 曲 霉 培 养 属 散 曲 法 ， 而 黄 酒 用 曲 及 白 酒 用 曲 一 般 采 用 块 曲 法 。 固 态 制 曲 设 备 ： 实 验 室 主 要 采 用 三 角 瓶 或 茄 子 瓶 培 养 ； 种 子 扩 大 培 养 可 将
41、 蒸 热 的 物料 置 于 竹 匾 中 ， 接 种 后 在 温 度 和 湿 度 都 有 控 制 的 培 养 室 进 行 培 养 ； 工 业 上 目 前 主 要 是 厚层 通 风 池 制 曲 ； 转 式 圆 盘 式 固 态 培 养 装 置 正 在 试 验 推 广 之 中 。 固 态 培 养 微 生 物 ， 主 要 用 于 霉 菌 的 培 养 ， 但 细 菌 和 酵 母 也 可 采 用 此 法 。 其 主 要 优 点是 节 能 ， 无 废 水 污 染 。 单 位 体 积 的 生 产 效 率 教 高 。 实 验 过 程 ： 米 曲 霉 菌 种 的 纯 化 ， 制 成 斜 面 ， 将 斜 面 菌 种
42、接 入 250ml 三 角 瓶 培 养 成 种 曲 ， 再将 种 曲 扩 大 培 养 （ 500ml ） 三 角 瓶 。 米 曲 霉 培 养 ： 分 为 斜 面 培 养 和 三 角 瓶 培 养 两 个 阶 段 。 三 角 瓶 培 养 物 在 工 厂 中 作 为 一 级 种 子 。 试 管斜 面 培 养 基 ： 豆 饼 浸 出 汁 ： 100 克 豆 饼 ， 加 水 500ml ， 浸 泡 4 小 时 ， 煮 沸 3-4 小 时 ， 纱 布 自 然 过 滤 ， 取 液 ， 调 整 至 5 波 美 度 。 没 100ml 豆 汁 加 入 可 溶 性 淀 粉 2 克 ， 磷 酸 二 氢 钾 0.1
43、克 ， 硫 酸 镁 0.05 克 ， 硫 酸 铵 0.05 克 ， 琼 脂 2 克 ， 自 然 pH 。 或 采 用 马 铃 薯 培 养 基 ： 马 铃 薯 200 克 ， 葡 萄 糖 20 克 ， 琼 脂 15-20 克 ， 加水 至 1000ml ， 自 然 pH 。 三 角 瓶 培 养 基 制 备 ： 米 曲 霉 的 培 养 基 ： 1 ： 麸 皮 40 克 ， 面 粉 （ 或 小 麦 ） 10 克 ， 水 40ml 。 2 ： 豆 粕 粉 40 克 ， 麸 皮 36 克 ， 水 44ml 。 装 料 厚 度 ： 1cm 左 右 ； 灭 菌 ： 120 ， 30min； 接 种 及 米
44、曲 霉 的 培 养 条 件 ： 米 曲 霉 固 态 培 养 主 要 控 制 条 件 ： 温 度 ， 湿 度 ， 装 料 量 ，基 质 水 分 含 量 。 固 态 培 养 前 ， 原 料 的 蒸 熟 及 灭 菌 是 同 时 进 行 的 ， 实 验 室 一 般 是 在 高 压 灭菌 锅 中 进 行 ； 但 在 工 厂 中 则 是 原 料 的 煮 熟 和 灭 菌 与 发 酵 分 别 在 不 同 的 设 备 中 进 行 。 这 点与 液 态 发 酵 是 不 同 的 。 28-30 ， 培 养 20 小 时 后 ， 菌 丝 应 布 满 培 养 基 ， 第 一 次 摇 瓶 ，使 培 养 基 松 散 ； 每 隔 8 小 时 检 查 一 次 ， 并 摇 瓶 。 培 养 时 间 一 般 为 72 小 时 。 3. 实 验 仪 器 、 设 备 和 材 料 恒 温 培 养 箱 或 者 固 态 培 养 室 ， 负 压 式 超 净 工 作 台 ， 显 微 镜 ， 水 浴 锅 ， 试 管 ， 茄 子瓶 ， 平 板 和 500ml 三 角 瓶 等 。
