1、第一章 细胞工程原理,概述 第一节 细胞全能性1、细胞全能性概念的发展2、植物活细胞具有生命特征属性 第二节 脱分化与再分化 第三节 再生植株形成途径1、器官发生2、胚胎发生 第四节 培养细胞的遗传变异1、变异增多现象及其价值2、变异遗传基础,要求：了解细胞全能性概念的发展；植物活细胞具有生命特征属性；掌握一些重要的 概念（植物细胞工程、细胞全能性、脱分化与再分化、器官培养、胚胎培养、组织培 养、细胞培养、原生质体培养等)、再生植株形成途径及变异增多现象及其价值。,第二章 离体培养基本技术,第一节 外植体的类型及其选择与处理 第四节 培养条件的影响1、植物材料的栽培管理 1、光照2、外植体的类
2、型及选择依据 2、温度3、外植体的预处理及灭菌 3、湿度4、PH值 第二节 培养基及其配制 5、气体成份1、培养基的种类及组成2、几类常用的培养基及其特性3、培养基的配制4、实验室的设计第三节 无菌技术1、无菌的含义2、常用的灭菌方法3、外植体的灭菌4、无菌操作步骤,第一节 外植体的类型及其选择与处理,外植体(explant):用于接种培养的各种离体的植物材料。包括胚胎材料、各种器官、组织、细胞甚至原生质体等。 植物离体培养能否成功，既决定于培养基、培养条件等外在因素，也决定于外植体这一重要的内在因素。为了使外植体能在离体培养条件下存活与生长，必须对其进行细致的选择与处理，包括对供试植株的预处
3、理、接种材料的制备、以及对材料的灭菌与切取等方面。,第一节 外植体的类型及其选择与处理,一、植物材料的栽培管理1、栽培管理的重要性外植体的来源不同，取材部位不一和分离时期不同（年龄、季节、天气），杂菌的污染也不同。采取合理的栽培方法，尽可能降低对植物材料的生长和污染。2、注意事项、4月至8月间不适合材料的采取与分离；、用盆栽材料应注意清洁消毒土壤，取地下部材料时最好用蛭石最佳。、肥料的选择；、病虫害的防治；,第一节 外植体的类型及其选择与处理,二、外植 体的类型及选择依据2、外植体的类型及其优缺点 茎尖：最为常用的外植体。采用茎尖进行离体培养，不但生长速度快，繁殖率高，而且不容易产生变异，是最
4、理想的起始材料之一。可用于茎尖的生长、形态建成、花芽分化、组织分化、生理生态和营养代谢等问题。已成为园艺植物上最重要、最成熟的离体快繁途径。在植物脱毒培养时，多用茎尖作为外植体。 茎段、花茎或花梗（可带节或不带节）：在茎尖作为外植体材料缺少时可作为茎尖的替代材料。而花茎或花梗多用在花卉中作为外植体。,尽管所有的植物活细胞都具有再生的潜能，但并不是任 何细胞都能同等地表现出来。,第一节 外植体的类型及其选择与处理, 叶片：常用的外植体，操作简单，取材容易，能最大限度扩大外植体的来源。但叶片的分化程度较高，需要经过诱导愈伤组织再分化获得再生植株。另外，对那些再分化能力弱的植物种类而言，叶片离体再生
5、的难度相当大。 花蕾、花球和花药：含有较多的分生组织，有较强的分生能力。可经过胚状体的途径或经过愈伤再分化获得再生植株。花药培养多以获得单倍体植株为目的，可以加快育种进程。, 花瓣：起源于茎尖外围组织，本质上类似于叶片，但比叶片具更强的再生能力。是一种很好的外植体替代材料。多用于花卉的组培。 幼胚、成熟胚、种子：本身就是结构完整的小生命体，在培养过程中不须要经过脱分化和再分化就可形成完整的植株。同时，具有较强的胚胎发生能力，能极大提高繁殖系数。 子叶、下胚轴：胚的一部分，表现为再生能力较强，能直接诱导不定芽或胚状体。 根尖、根段、块根、块茎等：除根尖外，分化程度较高，须要经过脱分化形成愈伤组织
6、和再分化的过程，才能获得再生植株。一般来讲，较少用到这类材料。,第一节 外植体的类型及其选择与处理,3、外植体的选择依据生理状态：幼嫩、生长活跃成熟衰老、生长衰弱；春季秋冬季。一般情况下不提倡采用处于休眠状态的外植体材料（如休眠的枝条或种子）；芽在植株上部位，某些草本植物，如香石竹和菊花的顶芽或上部的芽容易培养成功，而中下部的芽则较难培养，这可能与芽内的激素和营养水平有关。木本植物的发育年龄：下部的芽或枝条上部的芽或枝条。返幼处理：嫁接、基部重截、生长调节剂。返幼处理后产生的问题。,发育年龄对培养材料的形态发生能力有较大的影响。 木本植物由幼龄小苗生长为成年或老年大树，是沿着植株 的主轴由下而
7、上生长，随着植株越长越高，顶端部分的发 育年龄也越来越大。换句话说，下部的芽及由其长成的枝 条的再生能力较强，越往上则越接近成年态甚至老年态， 其再生能力呈现递减趋势。现有的大多数离体培养实验基 本上证实了这一规律。就其原因，有人认为可能与DNA 的甲基化有关，有人则认为与细胞分裂的次数有关，需要 更多的探索研究。, 取材季节：外植体存在季节、天气状况、植株所处的代谢情况。 将植株种植于在温室内，从温室植株上取材，能够最大限度地克服季节与气候的干扰。, 外植体的大小：外植体越大，较易成活，但难以彻底除菌或病毒。一般为0.5-1.0cm大小。 其它：如优良基因型、健壮无病的母树等。,第一节 外植
8、体的类型及其选择与处理,第一节 外植体的类型及其选择与处理,三、外植体的预处理及灭菌 预先灭菌处理，减少初始带菌量；减少材料的初始带菌量是降低污染率的最有效的措施。如果初始带菌量过大，消毒灭菌时可能会出现材料被消毒剂杀死而微生物尚有存活的情况，将导致培养的彻底失败。为此，必须通过各种办法减少外植体的初始带菌量。长期晴朗的天气条件下取样、选择新萌发的幼芽或嫩梢、选择表面比较光滑的材料、对母株定期喷洒杀菌药剂、用纸袋或薄膜袋将枝条封套保护待其萌发新芽后取样、在室内采用水插促芽后采样，或是在温室植株上采样等。将材料流水冲洗过夜，可大幅减少带菌数量。, 清毒剂的杀伤力和材料的耐受力；不同的消毒剂种类，
9、因其渗透力和化学性质不同，对材料的杀伤力也不大相同。不同的外植体材料，因其大小、结构、幼嫩程度不同，对同一种消毒剂的耐受力也不相同。常用消毒剂：氯化汞、酒精、次氯酸钠、过氧化氢等。 清洗: 用无菌水彻底洗去残存的消毒剂。 内生菌的清除: 在培养基中添加一定浓度的广谱抗生素，抑制内生菌的繁殖，并通过多次继代培养逐渐消除。 切割与接种的技巧: 外植体大小、接种方向等,第一节 外植体的类型及其选择与处理,四、褐变的防止褐变是植物离体培养中一个比较普遍发生的问题，外植体接 种后，于伤口处发生褐化，产生褐色物质，不仅使培养基变褐，而 且很容易造成培养物死亡，或严重抑制外植体的脱分化和再分化。褐变问题已成
10、为离体培养的三大难题之一（另两个问题是污染 和玻璃化）。,第一节 外植体的类型及其选择与处理,发生褐变的材料与 正常的材料,褐变的原理 酚类化合物+多酚氧化酶 醌类(褐色) 影响褐变的因素 （）基因型：木本植物草本植物，同一物种的不同品种有不同 （）外植体的生理状态及发育年龄：与外植体的年龄、木质化程度、分化程度、成熟度、伤口大小，外植体体积等有关。 （）培养基组份的影响：液体培养基优于固体培养基；高浓度的无机盐、蔗糖、丝氨酸、铵态氮、硼素及细胞分裂素类的BA、KT等加剧褐变发生，而生长素类如2，4-D和NAA则能延缓多酚合成，故能减轻褐变。 （）培养条件：强光和高温会加剧褐变的发生。 （）每
11、代的培养时间：,第一节 外植体的类型及其选择与处理,防止褐变的措施 （）选择适当的外植体； （）母株和外植体的预处理（遮光、低温、饥饿处理等） （）使用抗氧化剂、防褐变剂或解毒剂；通常使用的药剂有抗坏血酸、柠檬酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清蛋白、活性碳等； （）培养方式和培养条件； （ 5）连续转移。,第一节 外植体的类型及其选择与处理,第二节 培养基的种类及其配制,一、培养基的种类及组成1、培养基的种类 培养基有许多种类，根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基。培养基的产生最早是Sacks(1680)和Knop(1681)，他们对绿色植物的成分进行了分析
12、研究，根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。,第二节 培养基的种类及其配制,White培养基在40年代用得较多，现在还常用。60和70年代则大多采用MS等高浓度培养基，可以保证培养材料对营养的需要，并能生长快、分化快，且由于浓度高，在配制、消毒过程中某些成分有些出入，也不致影响培养基的离子平衡。 培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS培养基)，也有对某些成分进行改良称作改良培养基。 培养其可以按不同的分类标准进行分类：
13、 固化剂的使用：固体培养基和液体培养基 生长调节剂及附加成份：基本培养基和完全培养基,第二节 培养基种类及其配制,2、培养基的成分培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、生长调节物质、培养体的支持材料等五大类。 （1）水 是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。,（2）无机元素(inorganic element)：大量元素和微量元素 大量元素，指浓度大于100mg/L的元素, 有N
14、、P、K、Ca、Mg、S。 (1) N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是生命不可缺少的物质。在制备培养基时以NO3-和NH4-两种形式供应。大多数培养基既含有NO3-又含NH4+ 。供应的物质有KNO3、NH4NO3、Ca(NO3)2等。有时，也添加氨基酸来补充氮素。 (2) P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、ADP等的组成成分。在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有KH2PO4或NaH2PO4等。,第二节 培养基种类及其配制,(3)
15、K 是许多酶的活化剂，对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大，一般为1-3mg/L为好。制备培养基时，常以KCI、KNO3等盐类提供。 (4)Mg、S和Ca Mg 是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgSO47H2O提供。用量为1-3mg/L较为适宜；Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl22H2O提供。,第二节 培养基种类及其配制,微量元素 指小于100mg/L(0.5mM)的元素，Fe，B，Mn，Cu，M
16、o，Co等。 Fe 是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制做培养基时不用Fe2SO4，和FeCl3(因其在pH值5.2以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)，而用FeSO47H20和Na2-EDTA结合成合物使用。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。,第二节 培养基种类及其配制,（3）有机化合物(organic compound)：碳水化合物、维生素类、肌醇、氨基酸等。 a. 碳水化合物 提供能源、碳骨架和调节渗透
17、压。最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在1-5%。在胚培养、花药培养及原生质体培养时，蔗糖的深度往往较高。高压灭菌时，一部分糖会发生分解，制定配方时要给予考虑。,第二节 培养基种类及其配制,b. 维生素类(vitamins) 这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，但在数量上，还明显不足，通常需加入一至数种维生素，以便获得最良好的生长。主要有VB1(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、VB
18、3(烟酸)、Vc（抗坏血酸）、有时还使用生物素、叶酸、VB12等。一般用量为01-10mg/L。有时用量较高。VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，VB3与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc有防止组织变褐的作用。,第二节 培养基种类及其配制,c. 肌醇 (inositol)又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖转化而成，还可进一步生成果胶物质，用于构建细胞壁。使用浓度一般为100 mg/L，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。,第二节 培养基种类及其配制,d. 氨基
19、酸(amino acid) 是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸。有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它们是牛乳用酶法等加工的水解产物，是含有约20种氨基酸的混合物，用量在10-1000 mg/L之间。,e. 天然复合物椰乳、香蕉、马铃薯等其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。,第二节 培养基种类及其配制,1) 椰乳 是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在10-20%，与其果实成熟度及产地关系也很大。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯
20、茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用，但茎尖组织的大小若超过1mm时，椰乳就不发生作用。 2) 香蕉 用量为150-200ml/L。用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色。对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。 3) 马铃薯 去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过过滤，取其滤液使用。用量为150-200g/L。对pH值缓冲作用也大，添加后可得到健壮的植株。,第二节 培养基种类及其配制,(4) 植物生长调节物(plant growth regulators)生长素类和细胞分裂素类它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结
21、实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。,第二节 培养基种类及其配制,生长素类(auxin) 在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下，(10-5-10-8mg/L)就可促进生长，其次是茎和芽。常用的生长素有2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、NAA（萘乙酸，分和型 ）、IBA（吲哚丁酸）和IAA（吲哚乙酸）等。活性强弱：2，4-DNAAIBAIAA IAA(indo acetic acid 吲哚乙
22、酸) 是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。,第二节 培养基种类及其配制,NAA (naphthalene acetic acid萘乙酸) 在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍，可人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。 2,4-D (2，4-二氯苯氧乙酸) 起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但高浓度时它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过
23、量常有毒效应。,第二节 培养基种类及其配制,细胞分裂素类 ( cytokinin ) 这类激素是腺嘌吟的衍生物，包括6-BA(6-苄基氨基嘌呤)、KT(kinetin 激动素)、Zt (zeatin 玉米素) 、TDZ（噻重氮苯基脲）等。其中TDZ活性最强，但非常昂贵，6-BA和KT因为性质稳定且价格低廉，故在离体培养中最常用。在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长；促进细胞分裂与扩大；抑制根的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低。,第二节 培养基种类及其配制,激素配比模式生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向
24、，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。高 有利于根的形成和愈伤组织的形成生长素/细胞分裂素 适中 有利于根芽的分化低 有利于芽的形成,第二节 培养基种类及其配制,（）乙烯及其它生长抑制剂几乎所有的植物组织都能产生乙烯。乙烯的分子量很小，以气体的形态存在，可溶解在水和亲脂性物质中进行扩散或运输。乙烯的生理作用：促进果实成熟、促进脱叶和衰老；促进次生物质的排泌；促进菠萝开花、增加黄瓜等的雌花数量等。在离体培养中，生长素用量过高会诱发产生乙烯；当培养物生长得太密集拥挤、长期不予继代转接时，乙烯含量会增高，从而加速培养物
25、衰老或脱叶；较高的乙烯还引起植物在形态上的一些改变，如使豌豆的上胚轴加粗、失去负向地性等。,除此之外，离体培养中有时还会用到多效唑（PP333）、烯效唑、三碘苯甲酸（TIBA）、矮壮素（CCC）、比久（B9）、根皮苷、间苯三酚（根皮酚）等生长抑制剂，用以抑制徒长或细胞的旺盛分裂，提高试管苗的质量。有研究证明根皮苷可提高莲叶秋海棠、雪松、月季的芽苗分化，根皮苷分解后产生的根皮酚也有类似的效果；三碘苯甲酸则能够促进秋海棠的离体培养叶片形成芽等。,（5）培养材料的支持物琼脂(agar) 是最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养，不参与代谢。琼脂能溶解在热水中（9
26、0），成为溶胶，冷却至40即凝固为固体状凝胶。琼脂的用量在4-10g/L之间。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。,第二节 培养基种类及其配制,固体培养基与液体培养基相比：操作简便，通气问题易于解决，便于经常观察研究等。但它也有不少缺点，如培养物与培养基的接触(即吸收)面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用，同时培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。,第二节 培养基种类及其配制,（6）其
27、它添加物a. 抗生素(antibiotic)：青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5-20mg/L之间。(甲基托布津、多菌灵、百菌清都有较好的效果)添加抗生物质可防止真菌类污染，减少培养中材料的损失。对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5-10%的抗菌素。但是应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用。(过滤灭菌),第二节 培养基种类及其配制,b.活性炭(active carbon)活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用。茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物。在新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长，但其作用有一个
28、阈值，一般为0.1-0.2%，不能超过0.2%。活性炭在生根时有明显的促进作用。此外，在培养基中加入0.3%活性炭，还可降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用。但是，大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加一些琼脂。很细的活性炭也易沉淀，通常在琼脂凝固之前，要轻轻摇动培养瓶。,第二节 培养基种类及其配制,c. 染色剂的利用在进行离体培养研究时通常需配制多种培养基。除了用铅笔或油笔标记外，一个很好的办法，是在培养基中滴加1-3滴1的活体染色剂，如亚甲兰、中性红、甲基紫等，将培养基染成不同的淡颜色，由于染色剂用量极微，不会对培养物产生影响，能够节约大量时间。甲基紫除供染色之外，还
29、具有较强的杀菌作用，0.001即可有效地抑制细菌和部分真菌的生长。,第二节 培养基种类及其配制,二、几类常用的培养基 1、常用的培养基(1) MS培养基（高盐） 它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。 (2) B5培养基（高硝酸钾） 是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的氨态氮，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物
30、在B5培养基上生长更适宜，豆科作物多用。(3) White培养基（低盐） 是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MsSO4的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低，适于生根培养。（4）中盐型 如Nitsch、Miller等。,第二节 培养基种类及其配制,2、 培养基的选择1）无机成分；2）激素的应用；3）有机成分的添加。,第二节 培养基种类及其配制,母液的配制 （培养基的煮制）PH的调整培养基的分装与灭菌培养基的保存与使用,第二节 培养基种类及其配制,三、培养基的配制,1、母液的配制及保存 配制培养基的水最好是蒸馏水或双蒸水，
31、所用的化学药品应尽可能是分析纯或化学纯级别。药品的称量及定容都要准确，不同的化学药品须使用不同的药匙，以免药品的交叉污染。称量应非常仔细，并随时做好记录（品名、重量），以免重复或弄错。 最常规的方法，是预先配制培养基的各种母液（配成使用浓度的10倍、100倍或1000倍），贮存在2-4冰箱内备用。母液有两种形式：单一化合物母液，多种化合物的混合母液。,第二节 培养基种类及其配制,比如MS培养基，该配方中除蔗糖和琼脂外，还有19种成分，其中大多数化合物带有若干水分子。为减少工作量，提高效率，可把某几种药品（如大量元素）配成同一瓶母液，但应注意各种化合物的组合以及加入的顺序，以免发生反应。混合已溶
32、解的各种无机盐时还应注意先后顺序，必须把CaCl2与SO42-和PO43-错开；另外，Fe2+容易与OH-结合形成沉淀而失效，需单独配制成螯合态母液。,第二节 培养基种类及其配制,第二节 培养基种类及其配制,生长调节物质通常配制成0.1或1.0 mg/mL 的母液，既方便计算也可避免结晶。多数生长调节物质难溶于水，溶解方法又各不相同。大体上，酸类物质（生长素类和脱落酸）和苯基脲类物质可用少量的1 M NaOH溶解，碱类物质（腺嘌呤衍生物）可用1 M的HCl溶解，GA3和玉米素用95酒精溶解，IAA，IBA、NAA和2,4-D也可用95酒精溶解。,第二节 培养基种类及其配制,2、培养基的煮制及p
33、H值调整 将贮存母液按顺序放好，准备好量筒、烧杯、移液管、加样枪、玻璃棒、漏斗等。称量好琼脂、蔗糖、蒸馏水和激素类物质。先在锅内放一定量蒸馏水，加入琼脂和蔗糖并开始加热，按顺序加入所用的母液及生长调节剂 ，继续加热搅拌，待琼脂完全溶化后定容。由于培养基的pH直接影响材料对离子的吸收和琼脂的凝固能力（如果pH值高于6.0，培养基会变硬，低于5.0，则不能很好地凝固），故在分装前应调整好pH值。一般使用1 M的NaOH或HCl将pH值调节到5.4-6.0（用酸度计或精密试纸测试）。,第二节 培养基种类及其配制,3、培养基的分装与灭菌培养基要趁热分装，一般以占培养容器的1/41/5为宜。太多会浪费培
34、养基而且减少生长空间，太少则会导致营养不足。培养基富含营养物质，极易引起微生物滋生而发生污染，导致培养材料死亡。因此，培养基煮制分装后，须在高温高压（121时保持15-20min）的条件下进行彻底的灭菌处理，杀灭所有的微生物（特别是细菌的芽孢和真菌孢子）后，才能用于植物材料的接种培养。待培养基凝固后，放到培养室中预培养34d，若没有杂菌污染则可使用。,第二节 培养基种类及其配制,四、实验室的设计实验室的设计原则：科学、高效、经济和实用1、实验室的组成组培的实验室有化学实验室、无菌室、培养室、细胞学实验室、摄影室等，以化学实验室、无菌室、培养室为主必不可少。,第二节 培养基种类及其配制,水槽,天
35、平,冰 箱,仪 器 药 品 柜,工 作 台,培养瓶架,烘 箱,化学实验室,无菌操作室,培养室,缓冲间,超 净,工 作 台,培养架,培养架,推 拉 门,灭菌待用培养瓶架,灭 菌 设 备,实 验 室 的 布 局,一、无菌的含义这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。易传播，无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。,细 菌,真 菌,放 线 菌,第三节 无菌技术,无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方法必须已经证明是有效的)；高
36、层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部；强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部等都是无菌的。,灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。无菌技术的内容包括：材料、培养基、器皿和接种工具的灭菌，以及操作环境和工作台面的灭菌。通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台等)和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。,二、常用的灭菌方法灭菌方法可分为物理的和化学的两类。物理方法：干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水
37、冲洗等；化学方法：升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。,1. 湿热灭菌高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。适应范围：培养基、无菌水、栽培介质、接种用具，实验服、口罩等。,灭菌锅（小型全自动）,灭菌锅（大型自动）,2. 灼烧灭菌 在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入70%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入70
38、%的酒精，以便插入工具。,3. 干热灭菌是利用烘箱加热到160-180 的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽抱的抗热水平，通常采用170持续90min来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。干热灭菌能源消耗太大，浪费时间(3h)。,抗菌素和一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。,4. 过滤灭菌在滤膜的网孔的直径为0.45m以下时，溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，达到灭菌的目的。在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤
39、装置；液量小时，可用注射器。,5. 紫外线和熏蒸灭菌（空间）紫外线灭菌 在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是激发空气中氧分子缔结成臭氧分子(O3)，这种气体有很强的杀菌作用。 注意：低浓度的臭氧可消毒，但超标的臭氧会造成神经中毒，头晕头痛、视力下降、记忆力衰退、咽喉肿痛、胸闷咳嗽、引发支气管炎和肺气肿；诱发淋巴细胞染色体病变，加速衰老， 致使孕妇生畸形儿等。 熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按2ml/m2用量，将甲醛置于广口容器中，加过量高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可
40、预先喷湿以加强效果。,注意:甲醛有很大的毒性，易燃、易挥发，也是一种致癌剂。很容易通过皮肤吸收，对眼睛、黏膜和上呼吸道有刺激和损伤作用。操作时要远离热、火花及明火，始终在化学通风橱内进行，并戴合适的手套和安全眼镜，避免吸入其挥发的汽雾。,6. 喷雾灭菌（物体表面）物体表面如超净工作台面、桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。常用70%的酒精反复涂擦灭菌。,超净工作台超净工作台置于接种室内，是进行无菌操作的工作区。超净工作台一般由鼓风机、过滤器（多级）、操作台、紫外灯和照明灯等部分组成。在超净台工作面的上方应安装紫外灯，注意勿将紫外灯装入照明灯罩（玻璃板）内，否则不具有杀
41、菌作用。根据风幕形成的方向，可分为垂直式和水平式两类。工作原理：鼓风机将空气送入由特制的微孔泡沫塑料片层叠合组成的“超级滤清器”后吹送出来，由于滤清器孔径的限制，直径大于0.3 m的尘埃、细菌和真菌孢子都不能通过，从而形成连续不断的无菌空气流。优点：操作方便，预备时间短，工作效率高。超净空气的流速一般为每分钟24-30m，既能防止附近空气的袭扰，又不至于妨碍用酒精灯焰灼烧对器械，有利于保持材料不受污染。,超净工作台（单人）,超净工作台（双人）,三、外植体的灭菌外植体灭菌的程序：取材自来水冲洗70酒精消毒无菌水冲洗消毒剂处理无菌水冲洗接种第一步 预处理 预先灭菌处理，减少初始带菌量 第二步 表面
42、灭菌 在超净台内完成，用70%酒精浸10-30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。,预处理,表面灭菌,灭菌剂处理,最后一步清洗：清洗要每次3-5 min左右，视采用的消毒液种类，清洗3-10次左右。无菌水清洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。,常用灭菌剂使用浓度及效果比较表,第三步 灭菌剂处理。,备注：升汞又名氯化汞，无色
43、或白色结晶性粉末，质重，无臭。可溶于水、乙醇、乙醚和甘油。升汞是剧毒重金属，毒物危害程度为级(极度危害)。如升汞与皮肤接触，可用大量水冲洗后，湿敷3-5%硫代硫酸钠溶液。升汞液应装在棕色玻璃瓶中贮存。,1995年清华大学才女朱令铊中毒,http:/ 升汞(HgCl2): 剧毒的重金属盐杀菌剂，其杀菌原理是Hg2与带负电荷的蛋白质结合，使菌体酶蛋白变性失活。使用浓度0.1-0.2，一般浸泡处理612min就可有效地杀死附着在外植体表面的细菌及真菌，灭菌效果极好。但用升汞灭菌的外植体材料须用无菌水反复多次冲洗，才能洗去残留的汞，否则会对外植体产生毒害作用。通常用无菌水冲洗不得少于5次。由于升汞的毒
44、性剧烈，使用中务必注意安全。 次氯酸钠(NaClO): 用市售的“安替福民”配制2-10的NaClO，灭菌时间5-30min，无菌水冲洗45次。由于它分解出具杀菌作用的氯气，灭菌处理后易于除去，无残留，既有较强的杀菌力，又对植物无害，是常用的杀菌剂。 漂白粉：低毒有效的消毒剂，一般含10-20（重量/体积）的Ca(ClO)2，使用浓度一般为5-10或饱和溶液。因其易吸潮分解而失效，需密封贮藏且不能贮藏太久，应随配随用。 过氧化氢(双氧水)：常用6-12的溶液处理外植体材料，灭菌效果较好，由于该药剂在外植体表面容易除去，又不会损伤外植体，通常用于叶片材料的灭菌。在用上述药剂进行材料的灭菌处理时，
45、为了使杀菌剂湿润整个组织，有时还需在药液中加入润湿剂。如加入数滴或0.1的吐温（Tween）80或吐温20，或者用磁力搅拌、超声振动等方法使杀菌剂充分接触外植体，以利于彻底灭菌。,无菌操作的步骤： 在接种前20 min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯； 注意：使用操作台之前应开紫外灯15 min以上，以激发空气中的氧分子缔合成臭氧分子 (O3)，可以使紫外线没有直接照到的角落产生灭菌效果。由于臭氧有碍健康，在进入操 作之前应关掉紫外灯，10 min后方可入内。 (2) 接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等； (3) 上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处，然后擦拭
46、工作台面； (4) 先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干； (5) 接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等； (6) 接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30 min。,培养后可能会发生污染，怎么办？细菌污染和真菌污染细菌污染的特点：受污染的培养基呈粘液状、混浊状或发酵起泡，并伴有明显的酸臭气味，一般在接种后3-5 d即可表现出来。 细菌污染以芽孢杆菌污染最为普遍和严重，芽孢杆菌形成芽孢后，能够忍耐一定的高温高压、消毒剂及紫外线等灭菌处理。这种污染在早期不易发现，一旦发现，造成的污染损失可能就比较大。真菌污染的
47、特点：长霉，颜色多种多样，一般在接种后7 d以上方表现，长霉的部位可以是外植体，也可以是培养基。一些特别重要的材料若被污染，可以取出清洗后进行更严格的灭菌，重新接种培养。对污染的培养瓶应及时处理，最好是在未打开瓶盖之前，把所有的污染瓶集中高压灭菌，清除污物后洗净备用。,离体培养的优点之一就是在人工控制的环境条件下，使培养物生长发育，便于研究植物的生命活动，这是区别于大田及温室栽培的不同之处。但事实上，要控制离体培养的环境条件并非易事。因为各种植物所需要的环境条件不同，要求的适宜条件也不大相同，需要大量的设备。在目前在离体培养中，对许多环境因素还不很了解。在此仅介绍光照、温度、湿度、pH和气体条
48、件的影响。,第四节 培养条件的影响,1、光照(light) 1)光照强度(light intensity)光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，但不同阶段对光照的要求不一样。一般，500-1000lx/d，可以适合大多数植物培养的生长与分化。 2)光质(light wave)光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如烟草愈伤在蓝光下培养，形成的苗发育正常，在黑暗和红光及远红光条件下不能形成苗。 3)光周期(light period)试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。,CK Green Red,Blue Yellow,不同颜色的滤膜对丰香草莓再生的影响,1 week 2 week 3 week,4 week 5 week,暗处理对丰香草莓再生的影响,2、温度(temperature)离体培养的最适宜温度因植物种类和外植体类型不同而异。一般说来，低于15时，外植体会生长停滞，高于35时，则发生高温伤害，加快衰老甚至死亡。大多数植物最适培养温度在20-30之间，一般控制在252下培养较好。但对热带园艺植物应适当提高培养温度，一般控制在302为宜。总体上看，植物离体培养的适宜温度与其原来所处的生态环境（尤其是温度）关系密切，下表列出一些观赏植物的适宜培养温度。,
