1、桂 林 理 工 大 学 生 物 工 程 动 态课 程 论 文论文名称： 胰岛素的应用及发展前景 系（学院）： 化学与生物工程学院 班级： 学号： 学生姓名： 2013 年 12 月 18 日基因克隆技术摘要：随着转基因技术的发展，获取目的基因片段的方法也越来越多样化，获取目的基因片段的技术也日新月异，但是无论获取的方法和手段怎么样发展，获取的主要思路始终在围绕一根主线在开展。关键词：基因 ，遗传效应，基因克隆，体外重组一、基因工程基因工程作为一门理论性与实践性较强的学科,其方法与技术已经渗透到现代生命科学的各个分支领域,成为生命科学的一门核心技术。基因工程包含许多独特的实验方法和技术,不仅内容
2、丰富,涉及面广,实用性也强。基因工程是通过DNA 重组技术, 获得具有特殊生物遗传性状和功能的遗传工具生物体, 基因工程技术广泛应用于农业、医学、食品工业等。本文就基因工程的应用现状综合阐述。基因工程技术是一项极为复杂的高新生物技术, 它利用现代遗传学与分子生物学的理论和方法, 按照人类所需, 用DNA 重组技术对生物基因组的结构和组成进行人为修饰或改造, 从而改变生物的结构和功能, 使之有效表达出人类所需要的蛋白质或人类有益的生物性状。基因工程从诞生至今, 仅有30 年的历史, 然而, 无论是在基础理论研究领域, 还是在生产实际应用方面, 都已取得了惊人的成绩。首先,基因工程给生命科学自身的
3、研究带来了深刻的变化。目前科学家已完成了多种细胞器的基因组全序列测定工作。其次, 基因工程具有广泛的应用价值, 能为工农业生产、医药卫生、环境保护开辟新途径。基因工程( 又称DNA 重组技术、基因重组技术) , 是20 世纪70 年代初兴起的技术科学, 是用人工的方法将目的基因与载体进行DNA重组, 将DNA 重组体送入受体细胞, 使它在受体细胞内复制、转录、翻译, 获得目的基因的表达产物。这种跨越天然物种屏障, 把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力, 是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。基因工程研究内容为：(1) 从复杂的生物有机体基因组中, 经过酶切消化或P
4、CR 扩增等步骤, 分离出带有目的基因的DNA 片段。(2) 在体外, 将带有目的基因的外源DNA 片段连接到能够自我复制并具有选择记号的载体分子上, 形成重组DNA分子。(3)重组DNA 分子转移到适当的受体细胞, 并与之一起增殖。(4) 从大量的细胞繁殖群体中, 筛选出获得了重组DNA 分子的受体细胞克隆。(5) 从这些筛选出来受体细胞克隆, 提取出已经得到扩增的目的基因, 供进一步分析研究使用。(6) 将目的基因克隆到表达载体上, 导入寄主细胞, 使之在新的遗传背景下实现功能表达, 产生出人类所需要的物质。基因工程已有广泛应用，例如：在农业上的应用抗除草剂的植物基因工程资料表明, 每年杂
5、草造成的经济损失占农作物总产值的10%-20%左右尽管除草剂的使用, 对大规模机械化耕作, 减少劳力开支和提高量有极为重要的作用, 但一般除草剂的选择性较差, 即除了杀草以外, 还会将作物杀死。现在利用生物技术, 将能抵抗除草剂的基因转移到植物中, 获得抗除草剂的植物, 如美国的孟山都公司将除草剂草甘磷的靶酶( EPSPS) 的cDNA 克隆转入油菜, 目前, 已获得的抗除草剂作物有大豆、棉花、玉米、水稻和甜菜等20 多种。抗虫的植物基因工程生物防治害虫的工作已经开展多年, 主要是利用苏云金杆菌中的毒蛋白( 结晶蛋白) 对害虫有毒害作用, 使用这些杆菌来控制害虫。现在, 人们可以通过克隆这些毒
6、蛋白的基因(Bt 基因) 并把这些基因转移到植物细胞中, 从而获得能抗虫的转基因植物。目前, Bt 基因已被转入烟草、番茄、马铃薯、水稻、玉米及棉花等多种植物中。1996 年转Bt 基因棉花在美国种植66 万hm2 经中国农科院棉花所引进在华北试种两年, 在多点表现突出, 在完全不喷杀虫剂的情况下, 单产仍然高于喷撒2- 3 次杀虫剂的中国推广棉花, 显示出了控制棉铃虫的极好前景。动物转基因育种动物基因工程研究主要集中在改良家畜、家禽的经济性状和通过转基因动物进行药物或蛋白质的生产等方面, 目前已取得了显著的成就, 先后培育出转基因猪、羊、牛和鱼等, 另一种转基因猪是带有人体基因的猪, 这种转
7、基因猪客望能解决人体移植动物器官的遗体排斥问题。随着动物基因工程技术的逐渐成熟和转人体血红蛋白的基因猪、转人体血清蛋白的基因山羊等的问世, 不仅能生产出大量人类所需的血红蛋白、白蛋白等药物而且为动物育种开辟了一条全新的途径。在医学上的应用基因工程药物利用基因工程技术开发新型治疗药物是当前最活跃和发展最快的领域。自1982 年世界第一个基因工程药物- - - 重组胰岛素投放市场以来, 基因工程药物就成为制药行业的一支奇兵, 每年平均有3- 4 个新药或疫苗问世, 开发成功的约50 个药品, 诸如人胰岛素、忍尿激酶、人生长激素、干扰素、激活剂、乙肝疫苗等广泛应用于治疗癌症、肝炎、发育不良、糖尿病和
8、一些遗传病上, 在很多领域特别是疑难病症上, 起到了传统化学药物难以达到的作用。为治愈癌症正在研制的用单克隆抗体制成的“生物导弹”, 就是按照人类的设计, 把“生物导弹”发射出去, 精确的命中癌细胞, 并炸死癌细胞, 而不伤害健康的细胞, 比如专门用于肿瘤的“肿瘤基因导弹”等。可见, 生物工程药物将成为 21 世纪药业的支柱。而脱氧核糖核酸或者基因疫苗的问世, 变革了机体的免疫方式。如今, 人们翘首关注困扰人类的艾滋病病毒疫苗的早日问世。尽管目前诱变育种技术仍是改良微生物工业生产菌种的主要手段,但是基因工程技术在改良工业生产菌种方面已有成功的报道。最常见的是将控制药物合成关键步骤的酶基因克隆,
9、通过适当的载体转移到原生产菌中,以使控制限速步骤的酶水平,从而提高产量。Malmberg 等构建了一种带有编码赖氨酸 -氨基转移酶基因( lysine-aminotranster-ase,LAT)这种控制 Streptomyces clavuligerus 生物合成头霉素 C 的限速步骤的关键酶的基因(lat)的高拷贝质粒,并转入这种头霉素产生菌,使 LAT 提高活力提高了 4 倍,在 2 L 发酵罐中产生头霉素的能力是原来的 2 倍,重组菌胞外 LAT 产物 -氨基己二酸的积累量也比原受体菌高。伊维菌素( ivermectins)是一个市场很大的抗虫抗生素,其前体阿弗米丁(avermecti
10、ns)的产生菌种的发酵液中有 8 个以上的组分,其中只有 B1a 组分才是制备伊维菌素的原料。Ikeda 等经过近十年的努力,已将阿弗米丁的生物合成基因簇全部搞清,并经过诱变与 DNA 重组,获得了仅产阿弗米丁 B2a 单一组分和 B1a、B2a 组份的重组工程菌,这不仅大大提高了阿弗米丁有效组分的发酵效价,且给提取、精制、半合成等后处理工序带来了很大的便利。可以预见,随着对各种工业生产的微生物药物生物合成途径的深入了解以及基因重组技术的不断进展,应用基因工程方法定向构建高产菌株的成功实例将越来越多。在抗生素发酵过程中供氧往往是一个限制因素,充足的氧气供给是药物工业发酵稳定和提高产量,降低成本
11、的关键。传统的解决方法如增加通气量等对设备要求高,能量消耗大。20 世 70 年代末在专性好氧菌透明颤(Vitreoscilla)中发现了血红蛋白(VHb),它能促进氧气扩散到细胞末端氧化酶上。于是人们想到了将其基因 Vgb 克隆到其它微生物中,以促进微生物在低氧条件下生长。 1988年Khosla等从Vitreoscilla中分离出Vgb基因并将之转入大肠杆菌(Ecoli),提高了大肠杆菌在溶氧量低于5%时对氧的利用率。目前已用克隆表达VHb的方法提高了放线紫红素、头孢霉素C、红霉素等产生菌及青霉素酰化酶基因工程菌的产量。血红蛋白基因工程的研究和应用,必将对抗生素工业和其它重组药物发酵工业的
12、节能等带来美好的前景。作为半合成头孢菌素类抗生素重要原料的7-氨基头孢烷酸（7-ACA),目前国内外仍以化学裂解头孢菌素C的工艺路线为主。国内外已报道可用经由GL-7-ACA的二步法(化学/酶法或二步酶法)来生产7-ACA,与化学裂解法相比不仅收率提高,且能大大减少环境污染,简化生产工艺。但二步法中关键的GL-7-ACA酰化酶在假单胞菌中表达量低而且分离纯化困难,限制了这种方法的应用。通过将GL-7-ACA酰化酶基因转入大肠杆菌中表达恰好可以解决这一问题。最近又报道可将编码2个酶的基因直接转入头孢菌素C的生产菌种中,使其在发酵时直接产生7-ACA。调节基因在药物的生物合成中也起着重要作用,增加
13、调节基因的基因量能够大幅提高药物产量。 Hopwood等将放线紫红素生物合成的一个调节基因act导入原产生菌,尽管基因的拷贝数仅增加了2倍,放线紫红素的产量却增加了3040倍。某些抗生素生产菌的产量不高,是由于其自身对该抗生素的抗性不高。因此,利用高拷贝质粒的基因量效应,增加菌种对自身产生的抗生素的抗性,可能增加抗生素的产量。例如,将氨基糖苷-6-乙酰转移酶基因导入卡那霉素和新霉素产生菌,由于提高了对氨糖类抗生素的抗性,产量提高了26倍基因治疗是指由于某种基因缺陷引起的遗传病通过转基因技术而得到纠正。临床实践已经表明: 基因治病已经变革了整个医学的预防和治疗领域。比如白痴病, 用健康的基因更换
14、或者矫正患者的有缺损的基因, 就有可能根治这种疾病。现在已知的人类遗传病约有4000种, 包括单基因缺陷和多基因的综合症。运用基因工程技术或基因打靶的手段, 将病毒的基因杀灭, 插入矫正基因, 得以治疗、校正和预防遗传疾病的目的。目前, 基因治疗已扩大到肿瘤、心血管系统疾病、神经系统疾病等的治疗。人类也已成功实现了肾、心、肝、胰、肺等器官的移植, 也有双器官和多器官的联合移植。基因治疗有两种途径: 一是体细胞的基因治疗, 一是生殖细胞的基因治疗。由于生殖细胞的基因治疗操作技术异常复杂, 又涉及伦理缓行之理充足, 故尚无人涉足。基因工程是20 世纪生命科学中最伟大的成绩, 开辟了生命科学的新纪元
15、。经过几十年的发展, 基因工程技术已成为一个巨大的朝阳产业, 它可以超越动物、植物、微生物之间的界限, 创造出新的生物类型。基因工程不仅在医学上应用广泛, 而且也广泛应用在工业、农业、冶金、环保、资源、能源、畜牧渔业等领域, 为人类的丰衣足食和健康长寿提供了持续的实用价值很高的产品, 发展前景极为广阔。当然基因工程的应用还有很多方面，而且还有很广阔的发展空间，希望以后有机会能接触跟多关于这方面的知识。参考文献：1 陈渝军, 林晶. 基因工程技术在医药卫生领域的应用及发展. 药品评价,2005, 2( 2) : 144- 145.2 童克中.基因及其表达.北京: 科学出版社, 2001.3 李尉
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