1、广宿主质粒载体在细菌中基因表达,第十九组,蒋娟华,张琦梅,熊丽莎,杨静静,实验步骤,主要内容,质粒,介绍,质粒介绍,质粒IncQ的特征是比较小，中范围拷贝数，宿主范围很广，包括很多革兰氏阳性细菌。最常见的有RSF1010, R300B, 和 R1162，这些很相似但不完全一样。大量载体都是从这四个主要质粒中发展而来，它们被广泛使用，比如在假单胞菌属中。这些质粒群不能自我转移，但如果有可结合的辅助质粒存在，便能转移到不同的细菌中。这些质粒需要能够进行复制的三种编码质粒的蛋白质(RepA-C)和能促进复制的物质。 质粒IncW群中有能进行自我转移也有不能转移的质粒。其中包括了解最少的接合质粒和研究
2、最多的质粒pSa和pR388。他们的复制包括基因编码复制蛋白质RepA,以及能促进复制的物质。 质粒pBBR1相对很小，并且可移动，他们编码复制蛋白质(Rep)，对维持质粒的稳定性很重要，甚至缺乏抗生素的选择中。据该质粒的亲和性研究表明它不属于广宿主IncC, IncP, IncQ, or IncW 质粒。因此，它代表一类非亲和性的群体。 自然存在的IncP质粒群能自我转移并且相对比较大。他们能被分成四个子群。属于IncP质粒群的能够在很多革兰氏阴性细菌中复制。并且被认为是距今为止最复杂（对革兰氏阴性菌而言）的质粒,pRS44质粒图谱,pRS48质粒图谱,实验步骤,3.1在pRS44 质粒中的
3、DNA序列结构3.1.1 准备DNA (pRS44)克隆的载体 3.1.2 用于克隆的DNA的分离和纯化 3.1.3大肠杆菌中DNA文库的构建 3.2转移DNA序列到非大肠杆菌的宿主 3.2.1.质粒pRS48的分离3.2.2.通过电穿孔把trfA基因插入荧光假单胞菌中 3.2.3通过热休克转化引入DNA序列到大肠杆菌S17-1中3.2.4接合,3.1.1 准备DNA (pRS44)克隆的载体,获得包含pRS44大肠杆菌菌株EPI300 接种 诱导 培养 提纯 用BamHI消化 阻止自我循环缩合 凝胶法纯化DNA,3.1.2 用于克隆的DNA的分离和纯化,提炼DNA 消化 凝胶电泳 获取DNA
4、片段再染色 纯化DNA,3.1.3大肠杆菌中DNA文库的构建,1、将选好大小的DNA于结合线性质粒PRS44载体，以10:1的比例。 2、把连接混合物1 0L导入EPI300-T1R菌 3，转染EPI300-T1R细胞，搅动，悬浮 4，把细胞悬浮液转移到下一个平板上， 5，转移最后的悬浮液到无菌试管中，,3.2.1.质粒pRS48的分离,同上,3.2.2 把trfA基因插入荧光假单胞菌中,1、在电穿孔之前将电穿孔管、细胞和pRS48放在冰上至少30分钟。 2、将混合液转移到一个0.2cm的比色皿中， 3、脉冲一次。 4、电穿孔后立即加入900 L预热的SOC介质，然后将混合物转移到试管中在30
5、震动培养1h。 5、将细胞转移到含有四环素的PIA中，在30培养一夜。 6、挑选几个转化株接种到含有四环素的LB肉汤培养液中培养一夜，在20%的甘油，在-80保存入库。,3.2.3通过热休克转化引入DNA序列到大肠杆菌S17-1中,1、取1%的DNA序列到10mL含有卡那霉素补充物的LB肉汤培养基中 2、在37C振荡（225250 rpm）培养2h。 3、纯化DNA质粒。 4、融化一份在冰上凝固的有活性的大肠杆菌S17-1。 5、添加1 L DNA质粒到解冻后的细胞中，用手指轻敲试管混匀 6、在冰浴中培养DNA/细胞混合物10 min。 7、 热休克细胞在42C的水浴槽中40 s，然后返回到冰
6、中。 8、添加900 L 的 SOC肉汤培养液，在37振动(225250 rpm)培养细胞1 h 9、把这些细胞涂在含有卡那霉素的琼脂培养基上，然后在37C培养一夜。 10、挑取转化株，保存100 L,3.2.4接合,1、接种10ml不含抗生素但有荧光假单胞菌的LB培养基于125ml的烧瓶中，在30过夜培养，并（225-250rpm）振荡。 2、从过夜培养后的荧光假单胞菌中，接种1%到10ml不含抗生素的LB培养基，125ml烧瓶中，使细胞在指数期早期（OD540 0.3-0.5）生长大约4个小时。 3、接种大肠杆菌S17-1序列到10ml不含抗生素的LB培养液中，在125ml烧瓶中，培养4小时。 4、在试管中混合2ml来自供体菌和受体菌的培养物，离心机离心4 000转/每分钟，离心5min 5、弃去上清液，重新悬浮细胞于100L的肉汤培养基中，并在没有挑选的情况下，影印到琼脂平板培养基上(见 Note 9). 6、30C培养一夜 7、第二天用无菌接种环从杂交地点挑取大部分微生物，然后重新悬浮在1 mL LB培养基中。连续稀释并取100L到含有卡那霉素的PIA琼脂上用于筛选。在30C连续培养48小时。 8、转化接合剂收集保存于20%的甘油中80C。,Thank You !,
