1、 ICS备案号：辽宁省地方标准DB21DB21/T 16932008食用菌液体菌种生产技术规程2008-11-28 发布 2008-12-01 实施辽 宁 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB21/T 16932008I目 次前言.II1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 技术要求35 接种三级固体种袋（瓶）和栽培袋（瓶）86 记录与存档87 贮藏运输88 操作人员培训9DB21/T 16932008II前 言本标准的编写原则是依据 GB/T1.12000标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则及 GB/T1.22002标准化工作导则 第 2 部分：标准中规范性技术
2、要素内容的确定方法而制定的。本标准由大连市质量技术监督局提出。本标准由大连市质量技术监督局归口。本标准由大连春天生物技术有限公司负责起草。本标准主要起草人：李东海、孙建军、韩玉才。本标准属首次发布。DB21/T 169320081食用菌液体菌种生产技术规程1 范围本标准规定了食用菌液体菌种生产厂房设施、生产设备、品种、生产工艺流程、技术要求、储藏运输和操作人员培训。本标准适用于食用菌液体菌种的生产。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否
3、可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T4789.28-2003 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB5749-2006 生活饮用水卫生标准GB9687-1988 食品包装用聚乙烯成型品卫生标准GB9688-1988 食品包装用聚丙烯成型品卫生标准GB50073-2001 洁净厂房设计规范GB/T12728-2006 食用菌术语GB150-1998 钢制压力容器NY/T528-2002 食用菌菌种生产技术规程3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1 食用菌液体菌种培养器 cultivation apparatus for edible
4、fungus liquid spawn也称之为液体菌种发酵罐，是指进行食用菌液体菌种培养的专用设备。要求不锈钢材质，符合GB1501998 钢制压力容器标准。3.2 移动式食用菌液体菌种培养器 mobile cultivation apparatus for edible fungus liquid spawn指在食用菌液体菌种培养器上安装了可移动的装置，培养器工作时能整体移动，而移动中又不影响培养器的性能。3.3 食用菌液体菌种接种器 edible fungus-liquid interface trap inoculator 指能将液体菌种从培养器中按无菌操作要求转接到食用菌固体培养基物料
5、上的设备。3.4 空气压缩机 air compressor指能为培养器提供压缩空气的设备。3.5 空气过滤器 air filter指能对培养器所用空气进行过滤的设备。3.6 罐压 jar-pressure指食用菌液体菌种培养过程中培养器保持的空气压力，单位：Mpa。DB21/T 1693200823.7 通风量 ventilation volume指液体菌种培养过程中每分钟通入培养基中的无菌空气的量。用 V/V（培养基体积/通入空气体积）标示。3.8 接种量 inoculation amount指接入培养器中的菌种的数量，以菌种体积与培养基体积的百分比标示。3.9 液体菌种菌龄 period
6、of liquid spawn running 指菌种接入培养基开始计算的液体菌种生长发育时间。3.10 煮罐 boiler指将内置电热棒式培养器加水后，进行高压蒸汽灭菌处理。3.11 培养器空消 empty fermenter cultivation apparatus指对用外源蒸汽灭菌，尚未加水投料的空培养器进行高压蒸汽灭菌。 3.12 培养器实消 full fermenter cultivation apparatus指对投料后的培养器进行高压蒸汽灭菌。3.13 投料 feeding指将配置好的培养基投放到培养器中。3.14 定容 constant volume指培养器中加入培养料后，加
7、水至所要求体积。3.15 排料 discharging指从培养器放料口排出培养料。3.16 放罐 empty pot指培养结束，将液体菌种从培养器内排出，接种到三级固体种袋（瓶）或栽培袋中。3.17 摇瓶液体种 liquid spawn in shake pot指装在玻璃三角瓶内在摇床上恒温振荡培养的液体菌种。3.18 固体专用种 solid special spawn指在玻璃三角瓶或聚丙烯瓶固体培养基内生长的纯食用菌菌丝体培养物。专供接入液体菌种培养器用。3.19 起始 pH 值 initial pH value指液体培养基配制后尚未接种时的 pH 值。3.20 镜检 microscopic
8、 examination指通过显微镜观察食用菌菌丝生长发育状态和有无杂菌污染的过程。3.21 加热棒灭菌 heating rod sterilization指用培养器内安置的电加热棒加热灭菌的方法。3.22 外源蒸汽灭菌 exogenous steam sterilization指用锅炉蒸汽给培养器灭菌的方法。3.23 固体专用种并瓶 solid special strain combination指将检验合格的固体专用种按无菌操作要求，转移至装有无菌水的大三角瓶中，充分搅拌呈均匀的液态菌种的过程。3.24 死角 dead angle指培养器蒸汽灭菌时未能达到彻底灭菌的地方。3.25 罐压回零
9、 jar-pressure returning to zeroDB21/T 169320083指液体菌种培养过程中，培养器内压力回到零点或成负压。3.26 除油去湿 oil-removal and moisture-removing指用专用设备将压缩空气中的油污和水分除去。4 技术要求4.1 技术人员4.1.1 液体菌种生产厂应有与液体菌种生产所需的专业技术人员。4.1.2 工作人员卫生要求4.1.2.1 工作人员应该保持良好的个人卫生，勤洗澡、勤换衣、勤理发、不保留长指甲。4.1.2.2 进车间必须穿戴经灭菌的工作服、口罩、鞋、帽。4.1.2.3 严禁在车间内吸烟、随地吐痰和乱扔杂物。4.2
10、 液体菌种生产厂房厂房设计达到 NY/T528-2002 标准要求。4.2.1 厂址要求食用菌液体菌种生产车间必须建在交通方便，水源和电源充足，无有害气体、烟雾、灰沙，远离垃圾场、畜禽场舍的地方，有硬质路面排水良好的道路。4.2.1.1 食用菌液体菌种生产车间必须建在交通方便，水源和电源充足，无有害气体、烟雾、灰沙，远离垃圾场、畜禽场舍的地方，有硬质路面排水良好的道路。4.2.1.2 车间地面应能防水、防腐蚀、防渗漏、防滑，易清洗，有适当的排水坡度（1.0%1.5%）和良好的排水系统，排水沟必须是圆弧式的明沟。4.2.1.3 墙壁和天花板应能防潮、防霉、防水、易清洗。4.2.1.4 门窗应设置
11、防蚊蝇纱网。4.2.1.5 车间入口处应设置洗手、消毒和干手设施。4.2.1.6 车间安装排气管道或者排风设备。4.2.1.7 液体种菌种接种间必须设置缓冲间。4.2.1.8 应设置与职工人数相适应的更衣室、浴室、厕所和工作休息室。4.2.1.9 车间设封闭式废物桶。4.2.2 发酵间按照 GB50073-2001 洁净厂房设计规范执行。4.2.3 接种间按照 GB50073-2001 洁净厂房设计规范执行。4.2.4 固体栽培种的灭菌间、冷却间、培养间符合 NY/T528-2002 食用菌菌种生产技术规程要求。4.3 生产设备与设施4.3.1 基本生产设备培养器、空气压缩机、空气过滤器、液体
12、菌种接种器、高压蒸汽灭菌锅、蒸汽锅炉、净化工作台、恒温摇床、恒温培养箱、冰箱、显微镜、磁力搅拌机、磅秤、天平、酸度计等。在经常停电的地方应有自备电源（发电机）。培养器、高压灭菌锅和蒸汽锅炉应使用经政府有关部门检验合格，符合国家压力容器标准的产品。4.3.2 常用生产用具玻璃三角瓶、接种器、接种用火环圈、试管、量杯量瓶、玻璃漏斗、定量定性滤纸、精密 pH 试纸等生物实验室常规用品。4.3.3 基本设施配料间、发菌间、冷却间、接种间、培养间规模要配套，布局合理，要有调温设施。4.3.4 化验室和菌种室化验室和菌种室要有相应的实验检测设备和制种用的灭菌设施和常规用具。DB21/T 169320084
13、于接种 器内检验符合 放罐标准罐压 0.03Mpa 温度 2426通风量 1：0.51：1.2（v/v）无菌 空气除油 去湿并瓶检验合格 磁力搅拌接种 2628121 123 高压蒸汽灭菌 40min定容 投料振荡培养 3d5d 经镜检符合标准 检验 合格液体菌种专用培养基 空 气摇瓶液体种调 制压 缩 机固体专用种灭 菌高压灭菌过滤器冷 却培 养 器液体菌种培养合格液体菌种三级固体种袋（瓶） 栽培菌袋液体菌种生产工艺流程图母 种4.4 培养原料符合 NY/T528-2002 食用菌菌种生产技术规程要求。4.4.1 化学试剂类符合 NY/T528-2002 食用菌菌种生产技术规程要求。4.4.
14、2 生物制剂和天然材料类除符合NY/T528-2002食用菌菌种生产技术规程要求外，水不溶性固体物料要过40目筛。4.5 生产品种符合 NY/T528-2002 食用菌菌种生产技术规程要求和 GB/T12728-2006 食用菌术语相关规定。应使用经省级以上农作物品种审定委员会登记的品种，并且从具有相应技术资质的供种单位引种且种性清楚。不应使用来源和种性不清或者生产性状未经系统验证的组织分离物作为菌种进入大规模生产。4.6 液体菌种生产工艺流程4.7 生产过程工艺要求4.7.1 容器4.7.1.1 母种使用玻璃试管和棉塞，试管 18mm180mm 或 20mm200mm，棉塞要使用梳棉，不应使
15、用脱脂棉。DB21/T 1693200854.7.1.2 专用固体种和摇瓶液体种使用 500ml1000ml、耐 126高温的无色或近无色的玻璃菌种瓶。各类容器都应使用棉塞，棉塞应符合 4.7.1.1 规定；棉塞外要加盖 4 层纱布，灭菌时纱布外加盖牛皮纸防潮。4.7.2 培养基配方4.7.2.1 母种培养基一般使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）或综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基（CPDA） ，特殊种类需加入其生长所需特殊物质，如酵母粉、蛋白胨、麦芽汁、麦芽糖等，但不应过高，严格掌握 pH 值。固体专用种和摇瓶液体种培养基。4.7.2.2 固体专用种和摇瓶液体种培养基按4.4中培养原料的规定，根据
16、当地原料资源和所生产品种的要求，使用适宜的培养基配方，严格掌握含水量和pH值。用水符合GB-5749生活用水标准。4.7.3 分装母种培养基的分装量掌握在试管长度的四分之一至五分之一，灭菌后摆放成的斜面顶端距试管口不少于 50mm，固体专用种养基装至距瓶（袋）口不少于 60mm，灭菌后不少于 45mm。棉塞大小松紧要适度。培养基的松紧度要一致。摇瓶液体种培养基装量应为容器体积的 1/4。4.7.4 灭菌母种和固体专用种、摇瓶液体种培养基配制分装后应立即灭菌。母种培养基灭菌0.1Mpa0.12Mpa，30min,固体专用培养基灭菌 0.12Mpa， 1.5h 或 0.14Mpa0.15Mpa，1
17、h。装容量较大时，灭菌时间要适当延长。灭菌完毕后，应自然降压，不应强制降压。母种培养基、专用种培养基，应高压灭菌，不应常压灭菌。灭菌时应防止棉塞被冷凝水打湿。4.7.5 灭菌效果的检查母种培养基置于 28恒温培养，固体专用种和摇瓶液体种培养基经无菌操作接于前面GB4789.282003 中 4.8 规定的营养肉汤培养基中，于 28恒温培养，48h 后检查，并经显微镜镜检确定无微生物长出为灭菌合格。4.7.6 冷却冷却室使用前要进行清洁和除尘处理。地面铺消毒过的塑料薄膜后，将灭菌后的专用种瓶放置在冷却室中冷却到料温降至适宜温度。4.7.7 接种4.7.7.1 接种室（箱）的基本处理程序清洁搬入接
18、种物和被接种物消毒处理。4.7.7.2 净化工作台的消毒处理方法先用 75%酒精或新洁尔灭溶液进行表面擦拭消毒，然后开紫外灯灭菌 30min。4.7.7.3 接种操作在无菌室（箱）或净化工作台上严格按无菌操作要求接种。接种完成后及时贴好标签。4.7.7.4 接种室（箱）后处理接种室每次使用后，要及时清理清洁，排除废气，清除废物，台面要用 75%酒精或新洁尔灭溶液擦拭消毒，然后开紫外灯灭菌 30min。4.7.8 培养室处理DB21/T 169320086在使用培养室的前两天，采用药物消毒。4.7.9 培养条件根据不同培养物的不同生长要求，给予其适宜的培养温度（多在 2228） ，保持空气相对湿
19、度在 65%75%，通风，避光。摇瓶液体种置摇床上振荡培养，振荡频率随具体品种而定。4.7.10 培养期的检查各级菌种培养期间应定期检查，及时拣出不合格菌种。4.7.11 入库完成培养的母种和固体专用种及时登记入库。4.7.12 记录生产各环节应详细记录。4.7.13 留样各级菌种都应留样备查，留样的数量应以每个批号母种 3 支5 支，专用种 5 瓶7 瓶（袋） ，于46下贮存，贮存至经转接的栽培种袋（瓶）或栽培袋（瓶）至正常发菌。4.8 空气过滤器采用超高效空气过滤器。4.8.1 材质要求滤器外壳：321 不锈钢制造、内表面电子抛光，外表面镜面抛光处理。滤芯在额定风量下，对粒径 0.10.2
20、m 粒子的捕集效率，在 99.999%以上。空气阻力在 280pa以下。所有材质应耐 126高温。4.8.2 检查使用前要拆分检查滤芯，要求无油污、料污、无破损，外壳内外壁要求无污物、光亮洁净。4.8.3 灭菌高压蒸汽灭菌 121123、灭菌 40min。4.9 培养器检查与清洗4.9.1 检查检查罐上全部阀门、安全阀、压力表、要求完好，工作正常。4.9.2 清洗对罐体内、外和全部阀门用流水进行冲洗，达到无死角、内壁无任何培养料残余物的洁净程度。4.9.3 煮罐和空消培养器初次使用、出现染菌、长期放置、更换品种时，都要求煮罐和空消进行灭菌。有内置电加热棒的培养器加水至容积的 80%加热至 12
21、1，灭菌 40min。用外源蒸汽灭菌的培养器，蒸汽压力达到 0.1050.125Mpa、温度 121124、40min。4.10 液体菌种培养基配方4.10.1 原材料符合 NY/T5282002 标准要求。具体配方根据当地原料资源和生产品种的营养需求，使用适宜的配方，准确掌握加水量。用水符合 GB57492006，生活饮用水卫生标准。4.10.2 起始 pH 值常见食用菌品种，培养基调节起始 pH6.56.8。4.11 投料与定容DB21/T XX-2008DB21/T 169320087将配制好的培养基材料，加适量温水，搅拌均匀，倒入或用泵抽入培养器中，加水定容至所需体积，培养基投料量为罐
22、体总容积的 70%80% ，然后拧紧上料口盖。4.12 培养器实消和培养基灭菌培养器内蒸汽压力达到 0.105Mpa0.125Mpa ，培养基温度达到 121124、保持时间 40min，防止灭菌死角。4.13 排料有内置电加热棒的培养器灭菌时，当料温达到 121时从排料口将高温料液小流量排出，维持30min ，排料量为总体积的 4%左右。4.14 冷却降温灭菌结束将冷水通入培养器夹层或者内置冷却系统中循环，使培养基降温至 2428。注意降温过程中要及时向培养器内通风防止罐压回零。4.15 固体专用种并瓶选择无污染、菌丝生长正常、质量合格的固体专用种进行并瓶。并瓶应在无菌室或超净工作台内按无菌
23、操作要求进行。4.16 接种利用火焰保护接种法，把火圈放在投料口的上方点燃，此时打开进料口盖，把并瓶后的专用种迅速投入罐中，然后，迅速把上料口盖盖好，拧紧。移走火焰圈，接种完毕。液体种进入培养阶段。4.17 液体菌种培养条件4.17.1 调节通风量通过进气阀和排气阀将通风量调节至 1：0.5V V 1.2VV(料液体积空气体积)。4.17.2 调节罐压调节罐压保持在 0.02Mpa0.04Mpa 之间。4.17.3 培养温度常见品种培养温度调节在 2428范围内。少数品种根据特殊需求具体设定。4.17.4 培养时间一般品种在上述条件下培养3d5d可达到放罐指标。经镜检等方法检验质量合格即可放罐
24、接种。特殊品种的放罐菌龄，可根据该品种在培养器内菌丝的生长发育状态和其它理化指标变化情况具体确定。4.17.5 留样与检测4.17.5.1 留样并瓶后的菌种样品；培养器灭菌后的空白培养基样品；培养过程中定期从培养器中取出的样品，用作镜检和其它理化指标测定。上述样品放冰箱内保存一周以上。4.17.5.2 无菌检测对上述留存样品应在无菌检测琼脂平板上划线培养，在 28恒温培养 2d5d，每天观察菌落生长情况，若划痕上没有细菌、霉菌、酵母菌菌落生长，则表明该样品无杂菌。对留样样品应在取样后及时镜检，确定菌丝生长发育状态和有无杂菌污染。4.17.5.3 pH 值采用酸度计测定，应在规定范围之内。4.1
25、7.5.4 菌丝湿重DB21/T 169320088采用 15cm 的定量滤纸，将 100ml 液体菌液，过滤至无水滴滴下，称重后减去滤纸湿重。4.17.5.5 镜检采用显微镜，低倍、高倍、油镜，观察菌丝生长状况和有无杂菌污染。4.18 液体菌种放罐指标4.18.1 感官指标 见表 1表 1 感官指标 项 目 指 标菌液色泽 球状菌丝体呈白色，滤液呈棕色。菌液形态菌液稍粘稠，有大量片状或球状菌丝体悬浮、分布均匀、不上浮、不下沉、不迅速分层，菌球间液不混浊。菌液气味有食用菌液体培养时特有的香气，无异味，如酸、臭味等培养器排气口气味正常，无明显改变。4.18.2 理化指标 见表 2表 2 理化指标
26、项 目 指 标pH 值 在该品种正常范围内菌丝湿重（g100ml） 8显微镜下菌丝形态和杂菌鉴别 可见食用菌菌种液体培养中特有的菌丝形态，球状和丛状菌丝体大量分布，菌丝粗壮，菌丝内原生质分布均匀、染色剂着色深。无霉菌菌丝、酵母和细菌菌体留存样品无菌检查 有食用菌菌丝生长，划痕处无霉菌、酵母菌、细菌菌落生长4.19 放罐达到上述指标即可放罐。5 接种三级固体种袋（瓶）和栽培袋（瓶）接种于三级固体种袋（瓶）或栽培袋（瓶）中。接种前应保持正常罐压和冷水降温保存。5.1 接种环境达 GB500732001 洁净厂房设计规范相关标准。5.2 开启液体菌种接种器，进入自动消毒程序。5.3 将待接种的三级固
27、体种袋（瓶）或栽培袋放置接种器输送带，输入接种器的接种舱内。5.4 在接种器接种舱内，用接种枪将液体菌种注入三级固体种袋（瓶）或栽培袋（瓶）。5.5 执行接种器接种规程。动作迅速、准确。5.6 接种量每个接种点 15ml30ml。6 记录与存档母种、固体专用种、摇瓶液体种和培养器液体菌种生产的每个环节都要有详实的生产记录，由具体操作人员现场记录填写，定期由主管领导审核，签字后归档保存。7 贮藏运输DB21/T 169320089在培养器内通入无菌空气，保持罐压 0.02Mpa0.04Mpa，料温 610可保存 3d，1115可保存 2d，可短途运输，不宜长途运输。室温下保存种性易降低。8 操作人员培训从事液体菌种生产的各级操作人员，必须按照 “菌类园艺工国家职业标准”的要求进行专业培训，并取得相应的职业资格证书，方可从事食用菌液体菌种生产工作。
