1、Welch Materials, Inc.,HPLC技术系列讲座之- 色谱柱的日常维护及 应用解决方案,主讲人：陈再洁（技术部工程师）,月旭材料科技(上海)有限公司,一,四,三,二,色谱柱的正确使用,概 述,一、色谱柱的正确使用,阅读使用说明书,1）使用注意事项 2）pH使用范围 3）保存流动相,按箭头方向连接色谱柱,用流动相走基线至平稳,进 样,使用前的准备工作,按说明书要求活化色谱柱,使用缓冲盐时需要特别注 意置换， 不要使缓冲盐析出,特殊样品检测，需用样品溶液进行色谱柱老化,色谱柱的正确连接,HPLC的色谱柱接头,HPLC常用色谱柱接头：,50 mL 柱外体积（管线）,样品: 1. 苯丙
2、胺酸 2. 5-苯基-3, 6-二氧-2-哌嗪乙酸 3. Asp-Phe 4. 天冬甜素,0.12mm内径管线用于毛细管HPLC中2.1mm内径色谱柱 0.17mm内径管线用于分析型HPLC中2.14.6mm内径色谱柱 0.25mm内径管线用于半制备型HPLC中9.4mm内径色谱柱 0. 5mm内径管线用于制备型HPLC中21.2mm内径色谱柱,正确的PH使用范围,1、禁止在色谱柱PH值要求范围以外使用 2、避免在色谱柱临界PH值处长期使用,在什么样的PH值范围内使用色谱柱是正确的？,方法稳定区 方法波动区(pKa+1.5) 方法稳定区,液相柱-保留值与pH的关系,不同填料基质对PH不同的耐受
3、表现,有机无机杂化 硅胶基质(pH1.0-12.5）,硅胶基质 （pH 2-7.5）,Al2O3 nH2O (pH1-14）,聚合物基质(pH1-14）,Welch公司反相色谱柱使用范围； Ultimate是1.5-10.0 CN填料是1.5-9.0 Xtimate是1.0-12.5 Welchrom是1.5-10.0 LP系列填料是1.0-8.0,常见缓冲盐的PH值,缓冲液 pKa pH范围 磷酸盐pK1 2.1 1.13.1 柠檬酸盐pK1 3.1 2.14.1 甲酸盐 3.8 2.8 4.8 柠檬酸盐pK2 4.7 3.75.7 乙酸盐 4.8 3.85.8 柠檬酸盐pK3 5.4 4.
4、46.4 磷酸盐pK2 7.2 6.28.2 羟甲基甲胺 8.3 7.39.3 氨 9.2 8.210.2 硼酸盐 9.2 8.210.2 甘氨酸 9.8 8.810.8 1-甲基-哌啶 10.3 9.311.3 四氢化吡咯 10.5 9.511.5 二乙胺 10.5 9.511.5 三乙胺 10.7 9.711.7 磷酸盐pK3 12.3 11.313.3,正确的温度范围,问：为什么色谱柱有温度要求？ 答：1、得到良好的时间重复性；2、适当的提高柱温，可以减小流动相的粘度，降低色谱柱背压；升高柱效；3、柱温过高，会加快填料的溶解，缩短色谱柱使用寿命.,问:色谱柱的正确使用温度是多少？ 答：4
5、0 （正常寿命） ；40 （缩短寿命） 。,良好的化学性能,各相之间良好的互溶性,合适的缓冲盐浓度,适宜的PH值范围,适宜的有机相比例,相塌陷,甲醇水下的碳链形状,100%水下的碳链形状,水乙腈,0.1%的 醋酸,柱子加压 270bar 持续 10分钟,水/乙腈 (40/60) 1ml/min 30min,0.1%的 醋酸,普通C8柱0.1%的醋酸,阿莫西林的检测：,正确的保存,色谱柱内不含缓冲盐或离子对试剂长期保存80%左右有机相保存（甲醇或乙腈） （短期保存，可以用不含缓冲盐的流动相保存）塑料堵头拧紧,典型的有机物分析流程图,采集,样品处理,仪器分析,收集,提取,储存,浓缩,分离,定性,定
6、量,样品前处理的一般原则：,a、尽可能的除去样品杂质； b、使用流动相溶解样品； c、使用预处理柱（如：SPE小柱）除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质； d、使用0.45m的过滤膜过滤除去微粒杂质。,二、色谱柱的维护,色谱柱的维护,特殊维护,日常维护,特殊维护色谱柱出现异常时的维护,柱压升高,柱效降低,固体颗粒物质堵塞 缓冲盐析出 填料污染,固定相的流失 强保留物质的累积,正 常 升 高,异 常 升 高,什么是柱压正常升高？,缓慢升高,柱压在短时间 内快速上升,什么是柱压 的异常升高？,固体颗粒物质堵塞筛板,流动相和样品中的固体颗粒物质流动相抽滤过0.45um滤膜样品针筒过滤0.
7、45um滤膜,泵密封圈和管路磨损产生的固体颗粒物质接保护柱接在线过滤器,保护柱和在线过滤器,缓冲盐的析出,缓冲盐析是怎么析出的？,怎样防止缓冲盐析出？,有机溶剂/饱和缓冲液70/30,A,B,C,100%有机溶剂,A + B C,盐析出,缓冲盐析出原理,缓冲盐的正确使用方法,流动相走基线,过渡流动相过渡,进样,分析完成后用过渡流动 相反向冲洗40min,用甲醇或乙腈水溶液反向冲洗40min,过渡流动相：指有机相和水相比例与分析流动相相同，或者 水的比例”大于“分析流动相中缓冲盐溶液的比例,使用举例,甲醇/缓冲液70/30 走基线,进样,甲醇/水70/30 过渡,甲醇/缓冲液70/30 走基线,
8、进样,甲醇/水70/30 过渡,分析完成后用甲醇或乙腈冲洗色谱柱,固定相的流失,硅胶基质溶解规律高水、高温度、高pH 键合相流失规律 低pH、高水流动相pH、水相需限定在色谱柱允许范围内,强保留物质累积的维护方案,一. 流动相中不含缓冲盐分析完成后，用纯甲醇或乙腈冲洗色谱柱45min；,二. 流动相中含有缓冲盐分析完成后，先用过渡流动相冲洗45min，然后再用纯甲醇或乙腈冲洗色谱柱45min；,强保留物质累积的维护方案 Welch公司色谱柱最佳维护方案,一. 流动相中不含缓冲盐 分析完成后，用甲醇（或乙腈）：水90：10反向冲洗色谱柱45min；,二. 流动相中含有缓冲盐分析完成后，先用甲醇（
9、或乙腈）：水10：90反向冲洗45min，然后再用甲醇（或乙腈）：水90：10反向冲洗色谱柱45min；,色谱柱再生 （用下列每种溶剂2030倍柱体积冲洗）,反相色谱柱,100甲醇-100乙腈-75乙腈/25异丙醇-100异丙醇 -100二氯甲烷-100正己烷-100异丙醇,正相色谱柱,50：50正己烷/氯仿 - 甲醇 - 二氯甲烷或者100%醋酸乙酯 油脂类物质，可用异丙醇清洗,处理正相色谱柱 试剂严格除水,色谱柱柱体积,4.6 x 50 0.83 mL 0.624.6 x 30 0.5mL 0.37 4.6 x 250 4.15 mL 3.11 4.6 x 150 2.5 mL 1.87
10、2.1 x 50 0.17 mL 0.13 2.1 x 30 0.10 mL 0.08,色谱柱 空柱管 柱 尺寸 体积 体积 (mm) （mL） （ml）,三、异常色谱峰产生的原因和解决方案,常见异常色谱峰：,前延峰； 拖尾峰； 叉峰（裂峰）； 宽峰/馒头峰。,前延峰解决方案,几种常见的前延峰,峰前延解决方案,1. 样品过载,前拖、后拖或平头峰,2. 溶剂效应-使用流动相溶解样品,a.用纯甲醇溶解样品 Tf0.891,b.用流动相溶解样品 Tf1.072,流动相为乙腈：4%冰醋酸水溶液48：52,姜黄素标准品,用流动相溶解样品的替代方案,用流动相稀释至原来浓度的1/4倍,a. 用纯甲醇溶解样品
11、 Tf0.811,b. 将a图中的样品用流动相稀释至原来浓度的1/4倍 Tf=0.980,c. 用流动相溶解样品 Tf1.028,石杉碱甲标准品的测定 色谱柱： Ulitmate XBC18，4.6250mm； 流动相：甲醇：缓冲盐溶液(0.08M醋酸铵水溶液， 冰醋酸调节PH至6.0)25：75； 检测波长：308nm； 温度：室温26 度； 流速: 1 ml/min； 进样量：20ul,3. 缓冲盐浓度较低-增加流动相中缓冲盐的浓度,a. 乙腈：3%磷酸：无水乙醇80：10：10Tf0.737,b. （乙腈：3%磷酸：无水乙醇）80：10：10）：50mM磷酸二氢钠80：20 Tf0.93
12、0,注射用苦参碱的测定 色谱柱：Ultimate XB-NH2-2, 5um, 4.6250mm； 柱 温：室温24度； 流速：1.0ml/min； 检测波长：220nm； 进样量：20ul；,4. 流动相中加入适量的四氢呋喃,a . 50mM磷酸二氢钾（用2mol/L的KOH溶解调节pH5.0）/乙腈97.5/2.5 Tf0.873,c. 50mM磷酸二氢钾（用2mol/L的KOH溶解调节 pH5.0）/乙腈/THF97.5/2.5/1 Tf0.986,阿莫西林胶囊的测定 色谱柱：Ultimate AQC18，5um，4.6250mm； 检测波长：254nm； 温度：室温28度； 流 速：1
13、.0ml/min； 进样量：20ul；,5）柱温太低-适当升高柱温的温度,有助于增加流动相传质速率，减少因静电作用引起的前拖。,2）柱外死体积大,色谱柱反冲，修复色谱柱；选择性能良好的色谱柱。,硬件原因：,1）色谱柱损坏(筛板阻塞 和柱头塌陷 ) 、装填不当,用细径管路和小体积流通池，各接口连接紧密 。,拖尾峰解决方案,几种常见的拖尾峰,地红霉素：Tf = 1.268,二甲基苯氧乙酸：Tf = 1.991,头孢地嗪钠：Tf = 3.109,拖尾峰解决方案,通常非极性和弱极性的化合物能获得良好的峰形，而带有COOH、NH2、NHR、NR2等极性基团的化合物则比较容易产生拖尾,拖尾产生机理与分子结
14、构有关,这些基团的离子态 COO、NH3、NH2R、NHR2,拖尾峰解决方案,拖尾产生机理与残余硅羟基有关,硅羟基的特性：1）具有一定的极性SiOH2）SiOH的pKa为4.5 4.73）硅羟基的离子态 SiO,拖尾峰解决方案,头孢尼西钠的测定 50mg/100ml 用流动相溶解样品 Tf2.248,头孢尼西钠的测定 0.5mg/100ml 用流动相溶解样品 Tf1.068,头孢尼西钠的测定 色谱柱：Ultimate XBC18，5um，4.6250mm 波 长：272nm 流动相：0.01mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节PH3.5）：乙腈84：16 温 度：室温17 流 速：1.0ml/
15、min 进样量：20ul,样品过载对峰形的影响,色谱柱：Ultimate XBC18，5um，4.6250mm 波 长：280 nm 磷酸盐缓冲溶液的配制：准确称取磷酸二氢钠7.8g溶于 1000ml水中，搅拌均匀，使之溶解，用磷酸将pH值调至2.50 温 度：室温26 流 速：1.0ml/min 进样量：20ul,流动相：甲醇：磷酸盐缓冲溶液=70：30（混合好后，测得pH为4.07） N15633 Tf1.15,流动相：甲醇：磷酸盐缓冲溶液=70：30（甲醇和磷酸盐缓冲溶液混合好后用磷酸调节pH至2.49） N16719 Tf1.105,二甲基苯氧乙酸 结构式,流动相中加入酸,峰形后拖解决
16、方案,3. 增加缓冲盐或增大缓冲盐的浓度,溴化氢高乌甲素 结构式,色谱柱：Ultmate XB-C18, 5um, 4.6250mm 波 长：252 nm 流动相：甲醇：水75：25 温 度：室温 15 流 速：1.0ml/min 进样量：20 ul 用流动相溶解样品 N1281 Tf1.444,色谱柱：Ultmate XB-C18, 5um, 4.6250mm 波 长：252 nm 流动相：甲醇：50mmol/L磷酸二氢钠溶液75：25 （混合好后，用三乙胺调节pH至8.40， 即200ml混合好的溶液中加入75ul三乙胺） 温 度：室温 15 流 速：1.0ml/min 进样量：20 ul
17、 用流动相溶解样品 N9230 Tf0.987,头孢噻肟钠 结构式,色谱柱：Ultimate XB-C18, 5um, 4.6250mm 波 长：254nm 流动相：磷酸盐缓冲溶液：甲醇80：20（混合好后，测得pH为8.4） 缓冲盐的配制： 准确称取60mg磷酸二氢钾和磷酸氢二钠1.2g溶于1000ml水中，搅拌均匀 柱 温：室温12 流 速：1.0ml/min 进样量：20ul N3422 Tf2.503,色谱柱：Ultimate XB-C18, 5um, 4.6250mm 波 长：254nm 流动相：磷酸盐缓冲溶液：甲醇：三乙胺80：20：2 （混合好后，用磷酸调节至pH 8.4） 缓冲
18、盐的配制： 准确称取60mg磷酸二氢钾和磷酸氢二钠1.2g溶于1000ml水中，搅拌均匀 柱 温：室温12 流 速：1.0ml/min 进样量：20ul,流动相中加入三乙胺,2）柱外死体积大,色谱柱反冲，修复色谱柱，选择性能良好的色谱柱。,硬件原因：,1）色谱柱损坏(筛板阻塞 和柱头塌陷 )，装填不当,用细径管路和小体积流通池，各接口连接紧密 。,3）色谱柱被强保留物质污染,充分冲洗色谱柱 。,峰分叉（裂峰）,反向冲洗,进样次数少,进样次数多,柱污染,保护柱或分析柱被固体颗粒阻塞,a、取下保护柱再进行分析； b、更换保护柱； c、柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施； d、反向冲洗色谱柱。
19、,峰分叉（裂峰）,最有可能 的原因,修补色谱柱,柱头塌陷,峰分叉（裂峰）,进样溶剂化效应,峰分叉（裂峰）,样品溶剂极性小于流动相,样品溶剂尽可能与流动相匹配,用流动相溶解样品,其他原因及解决方案保护柱填料与分析柱填料不一致 - 更换保护柱，最好使用相同 厂家相同品牌的保护柱和分析柱流动相碱性过强 -由于硅胶溶解使柱塌陷,峰分叉（裂峰）,宽峰/馒头峰,物质在色谱柱扩展,宽峰/馒头峰,流动相,柱外效应,色谱柱,比例改变,流速太低,缓冲盐浓度低,样品池过大,记录仪响应时间太长,色谱柱与检测器间管路不适合,色谱柱或保护柱污染,柱头塌陷,色谱柱过载,柱温过低,比例改变,流速太低,缓冲盐浓度低,比例改变,
20、流速太低,流动相,缓冲盐浓度低,比例改变,流速太低,柱外效应,样品池过大,色谱柱与检测器间管路不适合,柱外效应,样品池过大,记录仪响应时间太长,色谱柱与检测器间管路不适合,柱外效应,样品池过大,色谱柱,色谱柱或保护柱污染,柱头塌陷,色谱柱,色谱柱或保护柱污染,色谱柱过载,柱头塌陷,色谱柱,色谱柱或保护柱污染,柱温过低,色谱柱过载,柱头塌陷,色谱柱,色谱柱或保护柱污染,色 谱 柱 使 用 过 程 中 的 不 良 习 惯,高流速再生色谱柱,纯水才能冲干净缓冲盐,使用缓冲盐时，不过渡,色谱柱污染后，不对仪器进行清洗,用极性相差太大的流动相互换,使用过程中突然增加或减小柱压,样品或流动相看不见杂质就不
21、过滤,塑料瓶装水或有机溶剂,纯水或缓冲盐使用多天,流动相混匀过滤、脱气后，又摇晃,四、色谱柱使用六大误区,色谱柱使用六大误区：,1、HPLC色谱柱不能反转使用：反转后会出现填料塌陷、键合相无法展开错误!装填色谱柱压力，约7000psi；装填方向和使用方向相反；某些厂家前后筛板孔径不一致；月旭公司的色谱柱两端筛板孔径是一致。,色谱柱使用六大误区：,2、保护柱不影响分离效果 ：错误!填料选择不当，引起保留时间漂移，甚至导致不同的 选择性；安装不正确，死体积加大，使峰形变差。,色谱柱使用六大误区：,3、提高温度有利于分离效果 ：错误!使低k值的物质几乎无保留, 很难定量；不同化合物对温度变化相应不一
22、致；缩短色谱柱使用寿命；温差较大，使峰变形。,色谱柱使用六大误区：,4、碳载量越高反相色谱柱就越好 ：错误!保留能力取决于被分析分子的相对疏水性 ；容易发生相塌陷； 保留时间的重现性较差 。,色谱柱使用六大误区：,5、新柱柱压越低，色谱柱越好 ：错误!分离度（R）、柱效（N）、选择因子（）和柱压没有关系；填料越密柱压越高；装柱压力约7000psi 。,各品牌柱压状况比较（以C18为例） 最低：迪马钻石一代岛津VP-ODS色谱柱 较低：Welch（Welchrom C18）依利特 （Sino-Chrom C18） 较高：Waters（Xterra、Xbrige、Symmetry），Agilent（Zorbax）Phenomenex（Luna、Gemini）迪马二代 （Diamonsil C18 II ）Welch（Ultimate、Xtimate）,色谱柱使用六大误区：,6、色谱柱应紧紧密封以防填料与空气接触而损坏 ：错误!色谱柱两头的微孔的直径不到0.2英寸；部分进入色谱柱，很难扩散接触足够多的填料；少量空气，在高压下会立即溶解，流出色谱柱。,欢迎提问！,疏水作用,存在状态,流动相的PH值,酸性物质：pKa - pH2,碱性物质：pH - pKa 2,离子状态,分子状态,
