1、绿色荧光蛋白基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 开题时间 2012 年 8 月 18 日 结题时间 2012 年 8 月 30 日 项目来源 本科生基因工程大实验课 一、立论依据 “绿色荧光蛋白基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达”项目的选题和研究的意义 国内外研究现状及发展趋势分析 主要参考文献及出处 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)最初是从多管水母(Aequorea victoria)中发现的一种蛋白质。当水母发光蛋白结合 Ca2+后发出蓝色荧光 ,该蓝光进一步激发绿色荧光蛋白产生绿色荧光。绿色荧光蛋白激发后发出的荧光持续时间较长,且不需要
2、任何其他辅助因子的作用。绿色荧光蛋白能在多种生物, 如细菌、粘菌、酵母、植物和哺乳动物中表达并产生荧光。绿色荧光蛋白的这一种属不依赖的特性使其成为能被广泛运用的荧光标记分子1。野生型绿色荧光蛋白的分子量较小 仅为 2730kDa 而编码 GFP 的基因序列也很短。GFP 由 238 个氨基酸残基组成。GFP 序列中的 65-67 位残基(Ser-Tyr-Gly)自发形成对羟基苯咪唑啉酮基团而可以荧光发色4。 在 1994 年发现绿色荧光蛋白后 国内外对绿色荧光蛋白的研究进一步发展 目前在基因表达中可以利用绿色荧光蛋白进行基因整合、细胞分选及转基因动物的研 根据其颜色的特殊性在细胞生物学中作为荧
3、光标记用于细胞动态的研究 在活细胞中可以利用其进行蛋白的定位 在 western blotting 中可作为一种体外检测手段2 。 在随着分子生物学理论与技术的发展,对绿色荧光蛋白的理论研究进一步深入,并且绿色荧光蛋白在分子生物学领域的应用进一步加强,绿色荧光蛋白工程,包括绿色荧光蛋白蛋白工程和绿色荧光蛋白基因工程的迅速发展,尤其绿色荧光蛋白 基因作为新型报告基因越来越受到关注,目前已经应用 GFP 作为选择标记基因成功构建多种表达外源基因的重组质粒2。 绿色荧光蛋白如要在各领域得到更加完整全面的应用, 至少还需要几个条件: 基础理论体系的成熟完善、新型优良突变体的诞生以及与各种现代生物技术的
4、融合。与此同时, 随着基因工程技术和细胞工程技术的日益成熟, 我们有理由相信,绿色荧光蛋白一定会给我们带来更多的应用价值, 并进一步揭开生命的未解之谜 3。 大肠杆菌 Escherichia coli 遗传背景清楚培养方便 转化效率高 繁殖快,而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统 因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。大肠杆菌中存在的 Lac 启动子受分解代谢系统活化蛋白和 cAMP 的正调控和阻遏物的负调控 当加入 IPTG 可与阻遏蛋白形成复合物 使阻遏蛋白构型改变 阻遏蛋白不再能与操纵基因结合 从而使结构基因表达 便于进行筛选。 本实验研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒 pET-trx-EGFP-N3 将重组质粒导入大肠杆菌体内 通过酶切、电泳及 IPTG 诱导检测是否成功诱导表达。根据电泳结果及荧光现象得出结论 重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。
