1、琼脂糖凝胶电泳法分离预染血清脂蛋白 【目的】 1. 掌握琼脂糖凝胶电泳法分离预染血清脂蛋白的实验原理和操作方法。 2. 熟悉血清脂蛋白改变在临床上的重要意义。 【原理】 电泳是指带电颗粒在电场的作用下，向着与其自身所带电荷相反的电极移动的现象。根据电泳支持物的不同，血清脂蛋白电泳可分为滤纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳四类。由于各种脂蛋白所含载脂蛋白和脂类的种类及数量不同，分子量大小相差较大，并且在一定 pH 值溶液中所带电荷量不同，电泳移动的速度必然有差别，因此，通过电泳可以将不同种类的血清脂蛋白彼此分离。 血清脂蛋白经苏丹黑 B 预染后，以琼脂糖为载体，在 pH
2、 8.6 巴比妥缓冲液中进行电泳，可将脂蛋白分成不同的区带（图 3-9 ）。正常人空腹状态下，血清脂蛋白电泳后可出现三条区带，从阳极到阴极依次为 - 脂蛋白带、前 - 脂蛋白带及 - 脂蛋白带。点样槽处不会出现乳糜微粒，有时前 - 脂蛋白也显示不出来。区带的宽窄及颜色的深浅粗略地反应了各种脂蛋白的量。 另外，可以将已烘干的凝胶片直接放到吸光度扫描仪上，通过扫描得出各种脂蛋白的百分比含量。或者，将电泳后凝胶板上各区带切下，比色定量分析出各种脂蛋白的百分比含量。 图 3-9 预染血清脂蛋白电泳图谱 【器材】 1 电泳仪 2 恒温水浴箱 3 离心机 4 微量加样器 5 烫槽器 6 载玻片 7 扫描仪
3、 8 分光光度计 9 小号试管 10 吸管 11 纱布 12 烘箱 【试剂】 1 电泳缓冲液（ pH8.6 ，离子强度 0.075 的巴比妥缓冲液） 称取巴比妥钠 15.458g ，巴比妥 2.768g ，乙二胺四乙酸（ EDTA ） 0.29g ，加适量蒸馏水溶解后加至 1000ml 。 2 凝胶缓冲液（ pH8.6 三羟甲基氨基甲烷缓冲液） 称取三羟甲基氨基甲烷 1.212g ， EDTA 0.29g ， NaCl 5.85g ，用适量蒸馏水溶解后加至 1000ml 。 3 琼脂糖凝胶（ 1% ） 称取琼脂糖 1g ，溶于 50ml 凝胶缓冲液中，再加蒸馏水 50ml ，然后在水浴中加热至
4、沸腾，待琼脂糖完全溶解后立即停止加热并分装于试管中，冰箱 4 保存，备用。 4 苏丹黑 B 染色液 将适量苏丹黑 B 加到无水乙醇中至饱和，震荡使之乙酰化，用前过滤。 5 固定液 取冰醋酸 5ml 加 75% 乙醇 95ml 。 6 预染血清 取空腹血清 0.18ml ，加苏丹黑 B 染色液 0.02ml ，混合后置于 37 水浴中染色 30min ， 2000r/min 离心约 5min 以除去悬浮于血清中的染料沉渣，取其上清液即为预染血清。 【操作】 1 制备琼脂糖凝胶板 将已配制好的 0.91% 琼脂糖凝胶于沸水浴中加热融化，用吸管吸取凝胶溶液浇注在水平放置的载玻片上，每片约 3ml 。
5、静置约 510min 即能凝固（天热时需延长时间，也可放入冰箱中数分钟加速凝固）。在即时凝固的凝胶板一端约 2cm 处用烫槽器加热后稍用力下压使之下陷接近玻片，切忌勿透，用滤纸片吸干槽中水分。 2 加样 用微量加样器取预染血清约 15l 注入凝胶板加样槽中。 3 电泳 将已加入预染血清的凝胶板水平移至电泳槽中，使加样端接在阴极一侧，用电泳槽缓冲液把四层纱布浸湿做成 “ 引桥 ” ，敷于胶板的两端，各搭住凝胶板约 1cm 左右， “ 引桥 ” 的另一端浸于电泳槽内的巴比妥缓冲液中，使血清样品扩散进入凝胶， 5min 后接通电源，电压 120130V ，电流约为 34mA/ 凝胶板，电泳 4050
6、min ，待最前端区带电泳至玻片 2 3 处时即可终止电泳。 4 固定 将电泳后的凝胶板浸入固定液中固定约 20min ，以增强区带的不溶性和加强与染料的结合力。 5 漂洗与烘干 将固定后的凝胶板用自来水漂洗数次，然后置于 80 烘箱中烘干成薄片状保存或进行扫描定量。 6 定量测定 （ 1 ）扫描定量：将已烘干的凝胶片直接放到吸光度扫描仪上，通过扫描得出各种脂蛋白的百分比含量。 （ 2 ）比色定量：将电泳后凝胶板上各区带切下，另外取相当于区带宽窄的无色凝胶作为空白对照，分别移入盛有 3ml 蒸馏水的试管内，将各管同时置于沸水浴中 5min 溶解为透明澄清的溶液，稍冷却，用分光光度计，选波长 6
7、00nm ，分别记录各管吸光度值。 【计算】 血清某种脂蛋白占血清总脂蛋白的百分比，按以下公式计算： 【注意事项】 1 电泳样品应为新鲜的空腹血清。 2 加热溶化琼脂糖时，须防止水份蒸发过多。琼脂糖凝胶最好随用随制，以免凝胶表面干燥，影响分离效果。 3 点样口要大小适宜，边缘整齐、光滑，否则会影响电泳图谱。 4 琼脂糖凝胶的浓度如果大于 1% ， - 脂蛋白和前 - 脂蛋白不易分开；浓度过低，则凝胶的机械强度太低，不易操作。 5 浇注琼脂糖凝胶板要尽量使厚薄均一，否则会影响脂蛋白的分离效果。 6 将凝胶板放入电泳槽中，应切记与电力线平行、样品端置阴极、引桥纱布不能搭在样品上。 7 如果用一形状大小和小槽一样的有机玻璃片，在琼脂糖凝胶凝固前固定于适当位置上，当凝固后取出有机玻璃片，凝胶板上即留下小槽可直接加样。 8 正常人空腹血清各种脂蛋白百分比含量参考值见表 3-11 。 表 3-11 正常人空腹血清各种脂蛋白百分比含量 种类 含量 - 脂蛋白 53.1 5.1 前 - 脂蛋白 15.1 4.1 - 脂蛋白 31.8 5.3 【思考题】 1 琼脂糖凝胶电泳的原理的优缺点是什么？ 2 试比较血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳与预染血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳的原理与方法。 3 试分析前 - 脂蛋白与 - 脂蛋白含量改变分别对人体健康的影响。
