1、实验名称：PCR 与基因分析实验一、 实验目的掌握 PCR 实验的原理、方法、技术，并初步了解 PCR 技术在基因分析中的应用。二、 实验原理PCR(Polymerase chain reaction)聚合酶链式反应，PCR 是一种选择性体外扩增DNA 或 RNA 片段的方法，其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。其原理类似于 DNA 的体内复制，是在试管中给 DNA 的体外合成提供合适的条件，包括模板DNA、寡核苷酸引物、DNA 聚合酶，合适的缓冲液系统和 DNA 变性、复性和延伸的温度与时间等。三、 基本实验步骤1. 变性 将待扩增 DNA 模板加热，一般变性温度为 95，双链 DNA
2、 变性成为单链DNA。2. 退火 两条引物分别与两条 DNA 的两翼序列特异性结合复性。退火温度（Tm）与引物序列的碱基组成、长度相关。3. 延伸 在适合的条件下，由 Taq (或其他)DNA 聚合酶催化引导 DNA 合成，即引物的延伸。延伸的温度一般是 72，适合的条件包括：这种热变性复性延伸的过程就是一个 PCR 循环。四、 试剂引物primer 是与待扩增 DNA 片段两翼互补的寡核苷酸，其本质是 ssDNA 片段。根据待扩增片段的不同，所需引物亦不同，特异的引物限定了 PCR 扩增产物的大小。一般 PCR 反应中引物的终浓度为 0.21mol/L， 在 此 范 围 内 ， PCR 产
3、物 量 基 本 相 同 。 如 果引物浓 度 低 于 0.2mol/L， 则 产 物 量 降 低 。 如 果 引 物 浓 度 过 高 导 致 非 特 异 产 物 合 成 ， 也 会 增加 引 物 二 聚 体 的 形 成 。耐热 DNA 聚合酶HotStar Taq Plus DNA Polymerase：是一种经化学修饰的 Taq DNA Polymerase，常温下没有聚合酶活性，避免 PCR 体系构建和循环初始阶段低温条件下非特异性引物的延伸和引物二聚体的形成。而酶活性的激活仅需要在 95 条件下孵育 15 min，该条件可以整合入已有的 PCR 热循环程序。缓冲液 10PCR Buffe
4、r：给 Taq DNA 聚合酶提供一个最适酶催反应的 pH 值和离子强度。Q-Solution：能有效扩增难扩增的模板，如二级结构复杂的模板和高 GC含量的模板；MgCl2：Mg2+是 Taq DNA 聚合酶活性所必需的,Mg2+浓度除影响酶活性与忠实性外, 也影响引物的退火 , 模板与 PCR 产物的解链温度,产物的特异性引物二聚体的形成等。Mg2+ 浓度过低时,酶活力明显降低;过高时,酶可催化非特异性扩增。三磷酸脱氧核苷酸dNTP：一般 PCR 反应中包括 dATP、dTTP、dCTP 、dGTP 四种三磷酸脱氧核苷酸，终浓度为 20200mol/L。模 板 DNA/RNA： 为 含 有
5、目 的 序 列 的 各 种 形 式 的 DNA 或 RNA。 在 实 验 中 ， 不 仅 需 要 待检 对 象 的 模 板 ， 同 时 需 要 做 对 照 实 验 ， 包 括 阳 性 对 照 和 阴 性 对 照 ， 前 者 一 般 指 应 用 非 相 关的 正 常 人 模 板 ， 后 者 指 在 体 系 中 不 加 模 板 ， 以 便 观 察 反 应 体 系 是 否 有 污 染 。PCR 水 ：为去离子的双蒸水。五、 PCR 反应条件选择温度循环参数1. 变性温度与时间：只有有效的变性才能使 PCR 顺利进行。典型的变性条件是 9530s-1min。在进行 PCR 循环之前，还需要进行预变性，
6、一般为 955min。因为如不能使目的基因模板和/或 PCR 产物完全变性，就会导致 PCR 失败。2. 复性温度与时间：合适的温度应低于扩增引物在 PCR 条件下真实 Tm 值的 5。引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。复性时间不能太短，应大于 30s，太长会增加非特异的复性。3. 延伸温度与时间：引物延伸温度一般为 72（较复性温度高 10左右） 。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性，也会影响其产量。72时，核苷酸的掺入率为 35-100 个核苷酸/s ，这取决于缓冲体系、Ph、盐浓度和 DNA 模板的性质。延伸时间决定于目的序列的长度与浓度，时间过长会导致非
7、特异扩增条带的出现。4. 循环数：循环数决定着扩增程度，一般在第 25-35 个循环过程中，扩增 DNA 量明显增加。循环数过多会增加非特异扩增产物的数量，太少 PCR 产物量就会太低。六、 HLA-Cw*0602 检测PCR 技术应用1. 背景：银屑病（Psoriasis）是一种常见的炎症性皮肤病，其特征性皮损表现为覆有银白色鳞屑的红斑，是由角质细胞的异常增生以及炎症细胞向真皮和表皮的浸润导致的。皮损可累及皮肤任何部位，好发于头皮、躯干和四肢伸侧。HLA-Cw*0602 是已报道的银屑病易感基因2. 应用：用于检测个体是否携带银屑病易感基因 HLA-Cw6。3. 方法：PCR 扩增，电泳检测
8、。4. 步骤：a 提取待检测者外周血 DNA；溶解 DNA，将其浓度稀释为 50100ng/ul。设立已知携带者对照（阳性对照） ，不携带者对照（阴性对照）和空白对照（体 系 中 不 加 模 板 ）。b PCR 反应试剂： 10PCR Buffer, Q-Solution, MgCl2, dNTP, HotStar Taq Plus DNA Polymerase，HLA-Cw6 primer(F/R)，内对照引物（通常选择 HLA-DRB1 基因第3 和 4 号外显子引物） ，10l 体系，比例如下：PCR 反应体系试剂（Reagents） 体积（Volume）10PCR Buffer 1.0
9、 lQ-Solution 2.0 lMgCl2 0.5 ldNTP(10mM) 0.2 lHotStar Polymerase（5U/l） 0.05 lDNA Template (50ng/l) 1.0 lHLA-DRB1primer(F/R)(30ng/l) 0.3 l/条HLA-Cw6 primer(F/R)(30ng/l) 1.0 l/条加 ddH2O 至 10.0 lc 按照一定的比例，加入到 PCR 反应管里，混匀点离后进行 PCR 反应。9515min9430s10cycles6430s 721min 9430s(-0.5/cycle) 26cycles5930s 7250s 72
10、15min 10突变检测中热启动 PCR 反应程序d 取 PCR 产物进行聚丙烯酰胺凝胶，300V 恒压电泳 1h，分析待检测者 HLA-Cw6基因结果。如果出现一条 308bp 的特异性条带以及内对照条带（为 782bp） ，则为阳性结果，说明该个体携带 HLA-Cw*0602 等位基因；如果仅出现内对照扩增条带，则为阴性，说明该个体不携带 HLA-Cw*0602 等位基因。附：聚丙烯酰胺凝胶电泳分为变性胶与非变性胶两种，区别在于前者中含有一定浓度的变性剂（尿素、甲酰胺或两者合用） 。其基本原理是单体丙烯酰胺在过硫酸铵与 TEMED(N,N,NN-四甲基乙二胺)的催化与诱导下聚合成长链，当有
11、 N,N-亚甲双丙烯酰胺参与聚合反应时，长链与长链之间就交联成凝胶，其孔径由链长与交联度决定，当 DNA 分子进入凝胶，在电场下进行泳动时，可根据各自迁移率的不同而得以分离。非变性胶可用于双链 DNA 分子的分离与纯化，变性胶可用于单链 DNA 分子的分离与纯化。由于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可消除DNA 分子不同构象对迁移率的影响，常用于进行遗传病家系的单体型分析。1、试剂：1） 30%丙烯酰胺： 丙烯酰胺 29gN,N-亚甲双丙烯酰胺 1g加去离子水至 100ml 室温避光保存2） 10%过硫酰铵（APS）： 过硫酰铵 1g加去离子水至 10ml 4避光保存3） TEMED（N,N,N,N-四
12、甲基乙二胺）4避光保存4） 10TBE： Tris 碱 108g硼酸 55g0.5M EDTA(pH8.0) 40ml加去离子水至 1000ml 高压蒸气灭菌，室温保存5） 8%丙烯酰胺（含 50%尿素）：丙烯酰胺 38gN,N-亚甲双丙烯酰胺 2g10TBE 25ml尿素 250g加去离子水至 500ml室温避光保存6） 100bp DNA ladder DNA 分子量标准：是由 10 条 PCR 扩增片段混合而成的。该 DNA ladder 由 10 条 1001000bp 的片段组成，大片段均比小片段增加100bp。7） 6非变性载样缓冲液： 二甲苯青 FF 0.025g溴酚蓝 0.02
13、5g0.5M EDTA(pH8.0) 300l蔗糖 4g加去离子水至 10ml 4保存2变性载样缓冲液： 二甲苯青 FF 0.0083g溴酚蓝 0.0083g0.5M EDTA(pH8.0) 100l加去离子甲酰胺至 10ml 4保存8）固定液： 无水乙醇 50ml 冰醋酸 2.5ml 加一蒸水至 500ml染色液： AgNO3 1g 加一蒸水至 500ml 显色液： NaOH 3.75g甲醛（30%） 2.7ml 加一蒸水至 500ml2、操作步骤：1）选择合适的垂直电泳槽与大小相配的两块玻璃板（其中一块为 U 形） ，及两玻璃板间的间隔片和点样梳。2） 用洗涤剂清洗干净两块玻璃板，烘干或晾
14、干，然后用无水酒精擦洗一遍。3） 装配灌胶板：在两块玻璃板间放好间隔片，在玻璃板两边夹好夹子，插上点样梳，根据梳子的松紧调整间隔片及夹子的位置，在两块玻璃板的底边封好一层胶带。4） 配制胶液（丙烯酰胺有神经毒，操作时要戴手套） 。6%非变性胶：30%丙烯酰胺 6ml10TBE 1.5ml10%过硫酸胺 300l去离子水加至 30ml8%变性胶： 8%丙烯酰胺（含 50%尿素）50ml10%过硫酸铵 500l5）封底胶：胶液配好后，充分混匀，取出 5ml 胶液加入 TEMED 10l，快速混匀后迅速倒进两块玻璃板之间封底胶。6） 灌胶：待底胶凝固后，剩余胶液内加 TEMED 20l，混匀，将玻璃
15、板倾斜，缓慢灌入胶液（注意灌胶时应连续，避免产生气泡，有气泡要及时去除） 。7） 胶液灌好后，在玻璃板上方插入相应的点样梳（插梳子注意去除梳齿下残留的气泡，且不要将梳子全部插入胶内，留约 2mm 在胶外，以免拔梳子时将胶孔桥拔断） 。8） 室温下让凝胶聚合约 1-2 小时。9） 配制 800ml 0.5TBE 电泳缓冲液（40ml 10TBE 加去离子水至 800ml） ，混匀后，加入上下电泳槽中。10） 小心拔下梳子，用电泳槽内的 TBE 冲洗胶孔（避免残留的丙烯酰胺再聚合，导致点样孔不整齐，影响电泳的带形） ，去掉封口的胶带以及玻璃板两边的夹子，将胶板用固定夹固定在电泳槽上（有凹面的玻璃朝
16、向电泳槽） ，接通电源，300V预电泳 10 分钟。11） 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，在待上样的 DNA 样本中加入 1/5 体积的 6非变性载样缓冲液，混匀后上样（上样时注意不要有气泡冲散了样品，且上样速度尽量快些，以免样品扩散） 。上样结束后，300V 恒压电泳，待二甲苯青 FF 指示剂电泳至合适的位置后停止电泳。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，在待上样的DNA 样本中加入等体积的 2变性载样缓冲液，置 PCR 自动热循环仪上 95变性 10 分钟，变性结束后样本立即插入冰上，上样（上样前需用注射器将上样孔再冲洗一次，以免残留的尿素结晶使得 DNA 电泳带型模糊变形） 。上样结束后700V 恒压电泳（最好是用带循环水装置的电泳设备于 50恒温电泳，可保证胶板温度均匀） ，待二甲苯青 FF 指示剂电泳至合适的位置后停止电泳。电泳结束后取下胶板，小心掀开玻板，移去间隔片，用银染法显色：将凝胶小心移入一托盘内，固定液固定 10 分钟 染色液染色 10 分钟一蒸水漂洗两次，每次半分钟显色液显色，至出现清晰 DNA 产物带型，凝胶用一蒸水漂洗一次后，转移到保鲜膜上，用保鲜膜包好。电泳结果拍照或用图像处理系统进行扫描。
