1、动物组织中核酸的提取与鉴定,内蒙古农业大学 生物化学与分子生物学实验教学中心,制作人：王瑞刚,实验原理实验试剂实验步骤,实验原理,动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖核酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。可用三氯醋酸沉淀出核蛋白，并用95%乙醇加热除去附着在沉淀上的脂类杂质。然后用10%氯化钠从核蛋白中分离出核酸(钠盐形式)，此核酸钠盐，加入乙醇可以被沉淀析出。析出的核酸(DNA与RNA)均由单核苷酸组成，在单核苷酸中含有磷酸、有机碱(嘌呤与嘧啶)或戊糖(核糖、脱氧核糖)。核酸用硫酸水解后，即可游离出这三类物质。用下述方法可分别鉴定出这三类物质：,1磷酸：用钼酸铵与之作用可生成磷
2、钼酸，磷钼酸可被氨基奈酚磺酸还原形成蓝色钼蓝。 2嘌呤碱：用硝酸银与之反应生成灰褐色的絮状嘌呤银化合物。 3戊糖(1)核糖：用硫酸使之生成糠醛，糠醛与3,5-二羟甲苯缩合而成为一绿色化合物：(2)脱氧核糖在硫酸作用下生成,-羟基-酮基戊糖，后者与二苯胺作用生成蓝色化合物：,实验试剂,1钼酸铵试剂 ：钼酸铵2.5g溶于20mI蒸馏水中，再加入5mol/L硫酸30ml，用蒸馏水稀释1OOml。 2氨基奈酚磺酸 ：商品氨基奈酚磺酸(1，2，4-Amino- naphthol Sulfonic Acid)为暗灰色。用下法提纯后使用:在100ml蒸馏水中(90)溶解15g亚硫酸氢钠及1g亚硫酸钠，加入1
3、.5g商品氨基奈酚磺酸，搅拌使大部分溶解(仅少量杂质不溶解)，趁热过滤，再迅速使滤液冷却。加入lml浓盐酸，则有白色氨基奈酚磺酸沉淀析出。过滤并洗涤固体数次。再用乙醇洗涤直到纯白色为止。最后用乙醚洗涤，并将固体放在暗处，使乙醚挥发。将此提纯的氨基奈酚磺酸保存于棕色瓶中备用。,氨基奈酚磺酸溶液配制：取195ml的15%亚硫酸氢钠溶液(溶液必须透明)加入0.5g提纯的氨基奈酚磺酸及20%亚硫酸钠溶液5ml。并在热水浴中搅拌使固体溶解(如不能全部溶解，可再加20%亚硫酸钠溶液，每次数滴，但加入量以lml为限度)。此为浓溶液。置冰箱可保存2-3周，如颜色变黄时，须重新配制。临用前，将上述浓溶液以蒸馏水
4、稀释10倍。3、3，5-二羟甲苯溶液取密度1.19的盐酸100ml，加入六水氯化铁100mg及二羟甲苯100mg，混匀溶解后，置于棕色瓶中。此试剂宜在临用前新配制。市售的3，5-二羟甲苯若不纯必须用苯重结晶一、二次，并用活性碳脱色方可使用。 4二苯胺试剂：取1g纯的二苯胺溶于100m1重蒸馏的冰乙酸中(或分析纯冰乙酸)，加入2.75ml浓硫酸，摇匀。放在棕色瓶中保存。此试剂需临用时配制。 5 0.9%Nacl。 6 20%三氯醋酸。 7 95%乙醇。,实验步骤,(一)匀浆制备称取新鲜猪肝(或大白鼠肝脏)5克，加入等量冰冷的0.9%NaCl溶液（可先放少量，待研磨成匀浆后加入剩余部分），及时剪碎
5、。放人研钵中加入少量石英砂，研磨成匀浆。研磨过程中，要随时将研钵置于冰中冷却。（匀浆制备一定要在低温条件下制作，操作要迅速，以避免核酸分解。）,(二)分离提取 1将匀浆5m1置于离心管内，立即加入20%三氯醋酸5ml，用玻棒搅匀，静3min后，以3000r/min离心l0min。 2倾去上清液，沉淀中加入95%乙醇5m1，用玻棒搅匀。用一个装有长玻璃管的木塞塞紧离心管口，在沸水浴中加热至沸，回馏2min。注意乙醇沸腾后将火关小，以免乙醇蒸气燃烧。冷却后2500r/min离心l0min。（脱脂）3倾去上层乙醇。将离心管倒置于滤纸上，使乙醇倒干。沉淀中加入10%氯化钠溶液4ml，置沸水浴中加热8 min ，并用玻棒搅拌。取出待冷却以2500r/min离心l0min 。4将上层清液量取体积后倾人一小烧杯内。若不清亮可重复离心一次。5取等量在冰浴中冷却的95%乙醇（在冰箱中），逐滴加入小烧杯内。即可看见白色沉淀析出。静置l0min后，转人离心管3000/min，离心10min，即可得核酸的白色钠盐沉淀。,（四）DNA与RNA成分的鉴定1磷酸的鉴定 取试管2支，按表操作,2嘌呤碱的鉴定:取试管2艾，按表操作,3核糖的鉴定 取试管2支，按表操作 将2支试管放入沸水浴内加热10min,4脱氧核糖的测定 取试管2支，按表操作将两管同时放人沸水浴l0min,
