1、2018/12/16,1,第十章 甾体激素类药物的分析,2018/12/16,2,甾体激素类药物是一类具有甾体结构的激素类药物， 有非常重要的生理功能。,分类(按药理作用):,结构特点：具有环戊烷并多氢菲母核。,类风湿性关节炎、频发性哮喘等,肾上腺皮质功能不全,休克,重症肌无力,甾,A环、B环有一个或两个双键,2018/12/16,3,主要可供分析基团： 1. 3-酮，C20酮基,3.C17:,2. C11：,肾上腺皮质激素(天然产物或天然产物的结构改造产物)：,氢化可的松,醋酸地塞米松,曲安西龙,地塞米松磷酸钠,地塞米松磷酸钠：增强水溶性,氢化可的松：天然皮质激素,醋酸地塞米松：肌注延长作用
2、时间,2018/12/16,4,雄性激素及蛋白同化激素(天然产物或天然产物的结构改造产物)： 雄性激素同时具有蛋白同化激素作用，经结构改造后，雄性激素作用减弱，同化作用保留或增强，成为蛋白同化激素。,甲睾酮,丙酸睾酮,苯丙酸诺龙,结构特点： 1. 3-酮基； 2. C17： 有羟基或酯基,丙酸睾酮：C17酯化后延长作用时间,蛋白同化激素,雄性激素,雄性激素：母核有19个碳原子 蛋白同化激素：母核有18个碳原子,C10一般无角甲基,C17- 羟基或它形成的酯,2018/12/16,5,孕激素 (天然产物或天然产物的结构改造产物)： 天然孕激素为黄体酮，口服无效，经结构改造后得到口服有效及长效衍生
3、物。,醋酸甲地孕酮,黄体酮,结构特点： 1. 3-酮基； 2. C17： 有甲酮基有些药物有羟基或酯基,2018/12/16,6,雌性激素 (天然产物或天然产物的结构改造产物)： 天然雌性激素为雌二醇，经结构改造得到高效及长效衍生物。,炔雌醇,雌二醇,结构特点： 1. A环为苯环 2. 3-酚羟基； 3. C17： 羟基有些药物有羟基成酯，或有炔基,2018/12/16,7,几种甾体激素类药物结构的比较：皮质激素：有21个碳原子，C17-酮醇基，或该醇基形成的磷酸酯或磷酸酯的二钠盐雄性激素：母核有19个碳原子 蛋白同化激素：母核有18个碳原子孕激素：母核有21个碳原子C17-甲酮基雌性激素 ：
4、母核有18个碳原子A环为苯环，C17上常有炔基,2018/12/16,8,鉴别试验,制备衍生物测熔点,光谱法,色谱法,呈色反应：与强酸反应(维生素D：醋酐+硫酸)官能团反应,化学鉴别法,UV IR,TLC HPLC,2018/12/16,9,甾体激素与硫酸、盐酸、磷酸、高氯酸等强酸反应呈色。,甾体激素与硫酸的呈色反应操作简便，不同药物可形成不同的颜色或荧光而能相互区别，反应灵敏，为各国药典所应用,2018/12/16,10,-醇酮基有还原性，可与碱性酒石酸酮试液(红色Cu2O)，氨制硝酸银试液(黑色Ag)，四氮唑试液反应。,还可用于皮质激素类药物杂质检查(TLC)时的显色剂，皮质激素类药物的含
5、量测定,不同的甾体激素药物有不同的官能团，利用官能团反应可区别不同药物。,1、C17-醇酮基的呈色反应肾上腺皮质激素类,2018/12/16,11,2、酮基的呈色反应C3和C20位的酮羰基可与羰基试剂(2,4-二硝基苯肼，硫酸苯肼，异烟肼等)反应，生成黄色的腙而用于鉴别。如黄体酮的鉴别：取供试品约0.5mg，置小试管中，加异烟肼约1mg和甲醇1ml溶解后，显黄色。,3、甲酮基的呈色反应黄体酮与亚硝基铁氰化钠反应，显蓝紫色，可认为是黄体酮的灵敏、专属的鉴别反应。其它分子结构中含有甲酮基的甾体激素呈现淡橙色或不显色。,4、酚羟基的呈色反应雌激素的C3位上有酚羟基，可与重氮苯磺酸反应生成红色偶氮染料
6、(JP：苯甲酸雌二醇)。,5、炔基的沉淀反应具有炔基的甾体激素药物(炔雌醇、炔诺酮等)，遇硝酸银试液，即生成白色的炔化银沉淀。R-CCH + AgNO3 R-CCAg + HNO3,还可用于含量测定,2018/12/16,12,6、卤素的反应对连接在C6,C9或其它位置上的氟或氯进行确认。(1)卤素连接在母核的环上：需用氧瓶燃烧法破坏，使有机卤素转变为无机卤素离子，再进行鉴别(如地塞米松磷酸钠，丙酸倍氯米松)。(2)卤素连接在侧链上：可通过加热水解方法产生卤素离子，再进行鉴别(如丙酸氯倍他索)。,7、酯的反应有些本类药物，在C17或C21位上连接有酯基，可将其水解，产生相应的羧酸，再根据羧酸的
7、性质进行鉴别(如醋酸泼尼松，己酸羟孕酮等)。,醋酸,在酸性条件下与乙醇生成醋酸乙酯，有香气,己酸，有特臭,2018/12/16,13,部分本类药物用测定衍生物熔点的方法进行鉴别 1、缩氨基脲的生成C3位的羰基和氨基脲发生缩合，生成缩氨基脲，可测定其熔点，对药物进行鉴别。如苯丙酸诺龙，产物熔点约为182，熔融同时分解。 2、酯的水解若结构是有机酸的酯，可水解后测定产物熔点。如丙酸睾酮C17位是丙酸和睾酮形成的酯，碱性水解后得到睾酮，熔点应为150156。 3、酯的生成某些药物有羟基，可与酰卤生成酯，可测定酯的熔点进行鉴别。如炔雌醇C3位上的羟基与苯甲酰氯成酯后，熔点为200202。 4、酮肟的生
8、成有些药物C3位的羰基可与羟胺形成肟，可测定肟的熔点对药物进行鉴别。如黄体酮与盐酸羟胺反应后生成黄体酮双肟，熔点为235240。,2018/12/16,14,UV： 甾体激素类药物有共轭结构或有苯环，有紫外特征吸收， 可规定其最大吸收波长max，max处的吸收度，或某两 个波长处吸收度的比值进行鉴别(如中国药典中丙酸倍氯米 松的鉴别 )。IR： 对于本类药物，几乎所有药物原料药都采用IR进行鉴别。,2018/12/16,15,TLC： 多数甾体激素类药物的制剂，部分原料药常采用TLC法进行鉴别。 如丙酸睾酮注射液：供试品和对照品配制浓度一致。展开后，供试液主斑点的颜色和位置应与对照液主斑点相同
9、。HPLC： 部分甾体激素类药物用HPLC法测定含量，可同时进行鉴别。 要求在一定色谱条件下，供试品的保留时间与对照品的保留时间一致。,2018/12/16,16,特殊杂质检查 甾体激素类药物通常要做“其他甾体”检查； 根据药物在生产和贮存过程中可能引入的杂质，有的药物还需做“游离磷酸盐”、“硒”及有机溶剂残留量检查等。,2018/12/16,17,甾体激素药物多由其它甾体化合物结构改造而来，可能引入的杂质有合成的原料，中间体，副产物，降解产物，异构体等，其结构一般未知，但具有甾体结构，与药物结构类似。 方法：TLC或HPLC法进行检查。,其它甾体检查,2018/12/16,18,TLC法：
10、多数杂质结构未知且与药物结构相似，用高低浓度对比法来检查。例：醋酸氟轻松中“有关物质”检查： 取本品，加三氯甲烷-甲醇（9：1）溶解并制成每1ml中约含3mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1ml，置50ml量瓶中，加三氯甲烷-甲醇（9：1）稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照薄层色谱法（附录 B）试验，吸取上述两种溶液各5l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（97：3）为展开剂，展开，晾干，在105干燥10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即检视。供试品溶液如显杂质斑点，不得多于2个，其颜色与对照溶液的主斑点比较，不得更深。氢化可的松和雌二醇见课本p252展开剂：不同比例的二氯甲
11、烷-乙醚-甲醇-水混合溶剂；苯-无水乙醇；二氯甲烷-甲醇-水；三氯甲烷-甲醇等。 显色剂：碱性四氮唑蓝试液；硫酸-乙醇(2:8；1:1；3:7)；20%硫酸；10%磷钼酸-乙醇液,2018/12/16,19,HPLC法 不少甾体激素药物用HPLC法测定含量，一般可在相同条件下检查其他 甾体。方法为主成分自身对照法。以供试品溶液的稀溶液为对照液， 将对照液主峰的面积作为参比，来控制药物中杂质的量。,例：黄体酮中“有关物质”检查： 取本品适量，精密称定，以甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶 液，作为供试品溶液，精密量取1ml，置50ml 量瓶中，加甲醇稀释至 刻度，摇匀，作为对照溶液。照含
12、量测定项下的色谱条件，取对照溶液10l，注入液相色谱仪，调整检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的50%。再精密量取供试品溶液 与对照溶液 各10l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，不得多于1个。其峰面积不得大于对照溶液 主峰面积的3/4 。,14.3,时间(min),14.3,22.2,2018/12/16,20,游离磷酸盐对于地塞米松磷酸钠，倍他米松磷酸钠来说，二者都是在C21位上羟基与磷酸形成的磷酸酯二钠盐，在药物的生产和贮存过程中可能引入磷酸盐，因此，要对药物中的游离磷酸盐进行检查。,例：地塞米松磷酸钠中游离磷酸盐检查精密
13、称取本品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml使溶解；另取标准磷酸盐溶液精密称取经105 干燥2 小时的磷酸二氢钾0.35 g ，置100ml量瓶中，加硫酸溶液(310)10ml 与水适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀；临用时再稀释10倍4.0ml，置另一25ml量瓶中，加水11ml；各精密加钼酸铵硫酸试液2.5ml 与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液(取无水亚硫酸钠5g、亚硫酸氢钠94.3g 与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸0.7g，充分混合，临用时取此混合物1.5g加水10ml使溶解，必要时滤过)1ml，加水至刻度，摇匀，在20放置3050分钟。照紫外-可见分光光度法（附录A），在740nm
14、的波长处测定吸光度。供试品溶液的吸光度不得大于对照溶液的吸光度。 原理：磷酸盐在酸性条件下与钼酸铵反应生成磷钼酸铵，再被1-氨基-2萘酚-4-磺酸溶液还原，所得磷钼酸蓝在740nm有最大吸收。比较供试液与对照液的吸收度控制药物中游离磷酸盐的量。,2018/12/16,21,硒的检查醋酸氟轻松，醋酸地塞米松，醋酸曲安奈德等甾体激素在生产过程中用到二氧化硒脱氢。二氧化硒对人体有剧毒，故需检查。原理：先将药物用氧瓶燃烧法有机破坏后，使硒转化为高价氧化物(SeO3)，以硝酸溶液吸收；再用盐酸羟胺将Se6+还原为Se4+；在pH2.0条件下，与二氨基萘试液作用，生成 4，5-苯并苯硒，被环己烷提取后，在
15、378nm有最大吸收。规定：供试液的吸光度不得大于硒对照溶液的吸光度。 醋酸氟轻松(0.01%)醋酸地塞米松(0.005%)醋酸曲安奈德(0.005%)。,2018/12/16,22,有机溶剂残留量测定 在甾体激素类药物合成过程中，用到的有机溶剂种类多，数量也多，故在部分品种中要测定有机溶剂残留量。,例：ChP中地塞米松磷酸钠中甲醇和丙酮的检查(GC法)取本品约0.16g，精密称定，置10ml 量瓶中，精密加0.1(ml/ml)正丙醇(内标物质)溶液2ml，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取甲醇约7.9mg与丙酮约79mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，精密量取1m
16、l，置10ml量瓶中，精密加内标溶液2ml，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取供试品溶液与对照品溶液，照残留溶剂测定法（附录 P），用高分子多孔小球色谱柱(按正丙酮计算的理论板数大于700)，在柱温150 测定。含量丙酮不得超过5.0%(g/g)，并不得出现甲醇峰。,2018/12/16,23,1、HPLC法 2、UV法3、比色法,异烟肼比色法 四氮唑比色法 Kober反应比色法,含量测定,2018/12/16,24,HPLC法广泛用于甾体激素类药物原料和制剂的含量测定(占中国药典收载原料 和制剂总量的一半以上)。多采用反相HPLC法，用内标法计算。,例：醋酸泼尼松龙的含量测定色谱条件与
17、系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水(70:30)为流动相；检测波长为240nm。理论板数按醋酸泼尼松龙峰计算不低于3000，醋酸泼尼松龙峰和内标物质峰的分离度应符合要求。 内标溶液的制备 取醋酸氟轻松，加甲醇制成每1ml中含0.50mg的溶液，即得。 测定法 取本品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.50mg的溶液；精密量取该溶液与内标溶液各5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取5l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取醋酸泼尼松龙对照品适量,精密称定，同法测定。按内标法以峰面积计算，即得。,2018/12/16,25,甾体激素药物含量测定的
18、色谱条件及方法：1、所用固定相均为C18柱，即ODS柱。十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)是应用最广泛的一种化学键合相，是非极性固定相，流动相为甲醇-水或乙腈-水的混合溶液，极性较大，属反相色谱系统。2、流动相一般为不同比例的甲醇-水或乙腈-水溶合溶液。3、不同甾体激素药物一般以不同的物质为内标。,2018/12/16,26,UV法部分甾体激素类药物原料和制剂的含量用UV法测定(约占中国药 典收载原料和制剂总量的1/4 。,例：醋酸甲羟孕酮片的含量测定 取本品10片(10mg,250mg规格)、15片(4mg规格)或25片(2mg规格)，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于醋酸甲羟孕酮20mg)
19、，置100ml量瓶中,加无水乙醇约60ml，振摇15分钟使醋酸甲羟孕酮溶解，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置另一100ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，照紫外-可见分光光度法（附录 A）在240nm的波长处测定吸光度，按C24H34O4的吸收系数（1%1cm）为408计算，即得,UV法由于快速，简便，曾广泛用于本类药物的含量测 定，但由于其专属性不强，有些品种的测定已被HPLC法 代 替。如醋酸地塞米松片的含量测定。,2018/12/16,27,甾体激素类药物C3或其它位置上的酮羰基在酸性条件下可与羰基试剂异烟肼缩合，生成黄色的异烟腙，在一定波长有最大吸收。,异
20、烟肼法,原理：,2018/12/16,28,供试品溶液：取本品适量(约相当于倍他米松20mg)，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀(必要时滤过) 对照品溶液：另取倍他米松磷酸钠对照品适量(约相当于倍他米松20mg)，精密称定，加甲醇溶解并稀释至每1ml 中含倍他米松0.4mg 的溶液。 精密量取供试品溶液和对照品溶液各1ml，分别置25ml量瓶中，各精密加异烟肼溶液(异烟肼75mg，盐酸0.1ml，加甲醇溶解并稀释至100ml)20ml，摇匀，置60水浴中保温1小时，冷却，加甲醇稀释至刻度，摇匀，照紫外-可见分光光度法(附录A)，在420nm 的波长处分别测定吸光度，计算
21、，即得。,例：异烟肼法测定倍他米松磷酸钠的含量,2018/12/16,29,肾上腺皮质激素类药物的C17-醇酮基有还原性，强碱性条件下可以还原四氮唑为有色化合物，通过测定该有色化合物最大吸收处的吸收度，来对药物含量进行测定。四氮唑盐有两类：氯化三苯四氮唑(ChP)，蓝四氮唑(USP)。,四氮唑法,原理：,2018/12/16,30,供试品溶液：取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于醋酸氢化可的松20mg），置200ml量瓶中，加无水乙醇适量，使醋酸氢化可的松溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液； 对照品溶液：另取醋酸氢化可的松对照品约20mg，精密称定，置200ml量瓶中，加无
22、水乙醇适量，使溶解并稀释至刻度，摇匀。 精密量取供试品溶液与对照品溶液各1ml,分别置干燥具塞试管中,各精密加无水乙醇9ml与氯化三苯四氮唑试液1ml，摇匀,再各精密加氢氧化四甲基铵试液1ml ，摇匀，在25暗处放置4045分钟，照紫外-可见分光光度法（附录A），在485nm 的波长处分别测定吸光度，计算，即得。,例：四氮唑法测定醋酸氢化可的松片的含量,2018/12/16,31,(1)药物结构：C11位是酮基的甾体比是羟基的反应速度快；C21位是羟基的甾体比其酯化后反应速度快，若酯是三甲基醋酸酯，磷酸酯或琥珀酸酯，速度更慢。 (2) 溶剂和水分：水分多会使呈色速度减慢，醛使吸收度增高，故溶剂
23、用无水无醛乙醇为好。 (3)碱的种类及加入顺序：氢氧化四甲基铵最常用。先加四氮唑盐再加碱液以防药物分解。 (4)空气中氧及光线：反应及产物对光及氧敏感，故需避光，暗处显色，并在达到最大呈色后，立即测定吸收度。 (5)温度与时间：中国药典的条件是在25的暗处反应4045min，以保证结果重现性。,四氮唑法广泛用于皮质激素类药物的含量测定，但下述因素对有色产物的生成速度、呈色强度和稳定性有影响：,四氮唑法的影响因素:,氢化可的松,2018/12/16,32,例：复方炔诺孕酮滴丸中炔雌醇的含量测定取本品10丸，除去包衣后，置20ml量瓶中，加乙醇约12ml，微温使溶散后，放冷，用乙醇稀释至刻度，摇匀
24、，滤过，取续滤液作为供试品溶液，另取炔诺孕酮与炔雌醇对照品适量，精密称定，用乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中约含炔诺孕酮0.15mg与炔雌醇15g的溶液作为对照品溶液。 炔雌醇 精密量取供试品溶液与对照品溶液各2ml，分置具塞锥形瓶中，于冰浴中冷却30秒钟后，各精密加硫酸乙醇(4:1)8ml（速度必须一致），随加随振摇，加完后继续冷却30秒钟，取出，在室温放置20分钟，照紫外-可见分光光度法（附录 A），在530nm的波长处分别测定吸光度，计算，即得。,用于雌激素的比色法测定。雌激素与硫酸-乙醇反应呈色，在515nm附近有最大吸收。本法用于测定部分雌激素的制剂中药物的含量。,Kober反应比色
25、法,2018/12/16,33,说明：在中国药典中对甾体激素类药物的原料及制剂的含量测定方法也在不断变化，随着HPLC法的广泛应用，某些该类药物品种的含量测定方法由比色法或UV法改为HPLC法，以提高测定的专属性，准确性。目前ChP 2005版中该类药物的原料及制剂品种的含量测定方法中，HPLC法占了一半以上。,2018/12/16,34,生物样品中甾体激素的分析对生物体内甾体激素类药物的分析方法要求专属性强，灵敏度高。常用GC和HPLC进行分析，并以质谱作为检测器，对甾体激素药物进行药物代谢，生物利用度研究及违禁药物监测。文献报道，用GC-MS对诺龙等19种蛋白同化激素的人体代谢进行了研究，
26、并在此基础上建立了系统分析和检测尿中同化激素的方法。 测定血清中醋酸甲地孕酮的含量，可用HPLC法，用于临床药浓监测和药代动力学研究。,2018/12/16,35,思考题 1、甾体激素类药物常分为哪几类？各自的结构特点是什么？ 2、常用于鉴别甾体激素类药物的方法有哪些？ 3、甾体激素类药物中游离磷酸盐的检查原理是什么？ 4、四氮唑盐比色法的原理是什么？都受哪些因素的影响？ 5、Kober反应比色法可用于哪些甾体激素类药物的含量测定？ 6、炔孕酮的含量测定：精密称取炔孕酮0.1g，加无水乙醇溶解并定量转移至100ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置另一100ml的量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀(成每1ml含10g的溶液)。照分光光度法，在240nm波长处测定吸收度为0.51。按C21H28O2的吸收系数(E1%1cm)为520，计算炔孕酮的含量。（98.08%）,2018/12/16,36,B,A,C,E,B,D,单选,2018/12/16,37,C,A,B,A,D,C,E,2018/12/16,38,C,A,B,D,E,A,D,D,B,D,2018/12/16,39,ACD,DE,多选,
