1、一、USP 方法5.2.12 抗 IIa 活性（20.035.0IU/mg）5.2.12.1 仪器：紫外可见分光光度计、低温循环槽、电子天平5.2.12.2 试液：醋酸溶液：取冰乙酸 42ml 于 100ml 容量瓶中，加水稀 释至刻度，混匀。pH7.4 聚乙二醇 6000 缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷6.08g 和氯化钠 8.77g 于 1000ml 容量瓶中，加水 500ml 溶解后，加聚乙二醇 6000 1.0g，用盐酸调节 pH 至 7.4，加水稀释至刻度。pH7.4 缓冲溶液：称取三羟甲基氨基甲烷 6.08g 和氯化钠8.77g 于 1000ml 容量瓶中，加水 500ml 溶解后，
2、用 盐酸调节pH 至 7.4，加水稀释至刻度。pH 8.4 缓冲溶液：称取三羟甲基氨基甲烷 3.03g、氯化钠5.12g 和乙二胺四乙酸二钠 1.40g 于 500ml 容量瓶中，加水250ml 溶解后，用盐酸 调节 pH 至 8.4，加水稀释至刻度。抗凝血酶 III 溶液：取 1 支抗凝血酶 III，加水溶解成5Units/ml。用 pH7.4 聚乙二醇 6000 缓冲液稀释成 0.5Unit/ml。人凝血酶溶液：用水将人凝血酶复溶，用 pH7.4 聚乙二醇6000 缓冲液稀释成 5Units/ml。显色底物：选择适合凝血酶的阿米酚试验的显色底物，用水稀释成浓度约 3mmol/L。临用前用
3、pH 8.4 缓冲溶液稀释至0.5 mmol/L。标准溶液：用 pH 7.4 缓冲溶液将 USP 依诺肝素钠活性标准品稀释为浓度 0.0150.070USPIU/ml 之间的四个浓度梯度。样品溶液：用 pH 7.4 缓冲溶液将依诺肝素钠样品稀释为与标准溶液浓度一致的浓度梯度。5.2.11.3 检测过程：取 18 支检测管，B 1、B2为 空白；T 1、T2、T3、T4为样品溶液，各双份平行；S 1、S2、S3、S4为标准溶液，各双份平行。按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2 的顺序，每管中加入抗凝血酶 III 的体积为 V
4、（2050l），和同样体积的 pH 7.4 缓冲溶液（空白）、标准溶液或样品溶液；混合，但不要产生气泡。于 37温浴 1 分钟。向每管中加入2V 人凝血酶溶液（40100l），温浴 1 分钟。再加入 5V 显色底物（100250l），4 分钟后加入 5V 的醋酸溶液（100250l ）终止反应。以 B1为空白，用紫外可见分光光度计在 405nm 处测量光吸收。空白 B2 的吸收值相比 B1 不得超 过0.05 。5.2.12.4 计算对每个浓度系列，将光吸收回归，与样品溶液和标准溶液的浓度对数值作线性分析。然后以量平行线分析统计方法计算每 mL 中依诺肝素钠抗 IIa 因子 IU 活性。4 个
5、浓 度溶液的计算值组合计算得到最终的平均值，然后计算可信限度。抗 IIa 因子用 IU/mg 表示，按干品 计。两人结果的相对平均偏差不得超过5.0%。5.2.13 抗 Xa 因子活性（90125IU/mg ）5.2.13.1 仪器：紫外可见分光光度计、低温循环槽、电子天平5.2.13.2 试液：醋酸溶液、pH7.4 聚乙二醇 6000 缓冲液、pH7.4 缓冲溶液、pH 8.4 缓冲溶液同抗 IIa 因子检测。抗凝血酶 III：取 1 支抗凝血酶 III，加水溶解成 5Units/ml。用 pH7.4 聚乙二醇 6000 缓冲液稀释成 1.0Unit/ml。Xa 因子溶液：用 pH7.4 聚
6、乙二醇 6000 缓冲液稀 释，使之在下述检测中 405nm 处光吸收每分钟增加不超 过 0.20，但要用体积为 V 的 pH7.4 的缓冲液代替依诺肝素钠溶液。显色底物：选择适合 Xa 因子的阿米酚试验的显色底物，用水稀释成浓度约 3mmol/L。临用前用 pH 8.4 缓冲溶液稀释至 0.5 mmol/L。标准溶液：用 pH 7.4 缓冲溶液将 USP 依诺肝素钠活性标准品稀释为浓度 0.0760.180 USP IU/ml 之间的四个浓度梯度。样品溶液：用 pH 7.4 缓冲溶液将依诺肝素钠样品稀释为与标准溶液浓度一致的浓度梯度。5.2.13.3 检测过程：取 18 支检测管，B 1、B
7、2为 空白；T 1、T2、T3、T4为样品溶液，各双份平行；S 1、S2、S3、S4为标准溶液，各双份平行。按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2 的 顺序，每管中加入抗凝血 酶 III 的体积为 V（2050l），和同样体积的 pH 7.4 缓冲溶液、 标准溶液或样品溶液；混合，但不要产生气泡。于 37温浴 1 分钟。向每管中加入 2VXa因子溶液（40100l），温浴 1 分钟。再加入 5V 显色底物（100250l），4 分钟后加入 5V 的醋酸溶液（100250l ）终止反应。以 B1为空白，用紫外可见分光光度计在
8、405nm 处测量光吸收。空白 B2 的吸收 值相比 B1 不得超过 0.05。5.2.13.4 计算对每个浓度系列，将光吸收的回归，与样品溶液和标准溶液的浓度对数值作线性分析。然后以量平行线分析统计方法计算每 mL 中依诺肝素钠 抗 Xa 因子 IU 活性。 4 个浓度溶液的活性对数值组合计算得到最终的几何平均值，同时计算可信限度。抗 Xa 因子用 IU/mg 表示，按干品计。两人结果的相对平均偏差不得超过 2.0%。二、EP 方法5.2.14 抗 FXa 因子和抗 Fa 因子活性检测：（2 人检测）5.2.14.1.溶液的配制5.2.14.1.1 缓冲液的制备5.2.14.1.1.1 三羟
9、甲基氨基甲烷的氯化钠缓冲液(pH 7.4)：溶解三羟甲基氨基甲烷 6.08g 和氯化钠 8.77g 于纯化水500ml 中，加牛血清蛋白 10g。用盐酸（取浓盐酸 85 ml 用蒸馏水稀释到 1000 ml，以下所用 盐酸无特殊要求外，指此浓度盐酸）调节 pH 至 7.4，用纯化水稀释到 1000 ml。5.2.14.1.1.2 三羟甲基氨基甲烷-EDTA 缓冲液(pH 8.4) ：溶解氯化钠 5.12g 和三羟甲基氨基甲烷 3.03g 和 EDTA二钠 1.4g 于纯化水 250ml 中。用盐酸调节 pH 至 8.4，用纯化水稀释到 500 ml。5.2.14.1.2 显色底物的制备：5.2
10、.14.1.2.1 显色底物 R1(N-苄氧基羰基-D- 精氨酰基-L-甘氨酰基-L-精氨酸-4-硝基苯胺的二氢氯化物)：显色底物 S-2765：用水溶解显色底物成 3mmol/L 的溶液。临用前用三羟甲基氨基甲烷-EDTA 缓冲液(pH 8.4)稀释成0.5mmol/L 的溶液。5.2.14.1.2.2 显色底物 R2(D-苯基丙氨酰基-pipecolyl-L-精氨酸-4- 硝基苯胺的二氢氯化物水溶液)：显色底物 S-2238：用水溶解显色底物成 3mmol/L 的溶液。临用前用三羟甲基氨基甲烷-EDTA 缓冲液(pH 8.4)稀释成0.5mmol/L 的溶液。5.2.14.1.3 牛 Xa
11、 因子参照液的制备：Xa 因子溶液：取 Xa 因子 1 瓶，加 pH7.4 缓冲液 10ml 溶解并稀释。5.2.14.1.4 Antithrombin(抗凝血酶)：用三羟甲基氨基甲烷的氯化钠缓冲液(pH 7.4)配制成含5IU/ml 的溶液，在 28下保存。5.2.14.1.5 Thrombin：用 pH7.4 缓冲液稀释至 5IU/ml，28下保存。5.2.14.1.6 抗凝血酶 R1 参照标准品的制备：用三羟甲基氨基甲烷的氯化钠缓冲液(pH 7.4)配制成含1IU/ml 的溶液。5.2.14.1.7 抗凝血酶R2 参照标准品的制备：用三羟甲基氨基甲烷的氯化钠缓冲液(pH 7.4)配制成含
12、0.5IU/ml 的溶液。5.2.14.1.8 30%乙酸：量取冰乙酸 30ml 于 100ml 容量瓶中，加水稀 释至刻度，混匀即得。5.2.14.2. 抗 FXa 因子活性检测：（抗 FXa 因子活性90IU/mg125IU/mg ）5.2.14.2.1 反应原理 低分子肝素（LMWH）+抗凝血酶（AT 过 量） 低分子 肝素抗凝血酶的复合物（LMWH-AT） 低分子肝素抗凝血酶复合物（LMWH-AT）+FXa (FXa过量) LMWHATFXa +FXa(剩余) 显色底物 R1（S-2765） 肽（peptide）+PNA Fxa剩 余( PNA 在 405nm 处有吸收特性。5.2.1
13、4.2.2 检测5.2.14.2.2.1 标准液的配制根据原标准液的抗 Xa 因子的浓度（104IU/ 安瓿），加超纯水 1ml 配成约含 104IU/ml 贮备液，使用之前用 pH7.4 的缓冲液稀释成最大浓度 0.18IU/ml、剂间比为 0.75 的四个浓度的对照液，分别记为 S1、S2、S3 和 S4。稀释方法：取 104IU/ml 标准液 0.0962ml 于 25ml 容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，得 0.400IU/ml 标准液。0.400IU/ml 0.180IU/ml1.0ml9缓 冲 液标 准 品0.180IU/ml IU/ml3526缓 冲 液标 准 品0.180IU/m
14、l 0.101IU/mll.4缓 冲 液标 准 品0.180IU/ml 0.076IU/ml370缓 冲 液标 准 品5.2.14.2.2.2 样品溶液的配制：首先估测样品的抗 FXa 因子含量（IU/mg），根据估 测样品的抗 FXa 因子含量将样品用用 pH7.4 的缓冲液稀释成与标准溶液相一致的四个浓度的检测液，分别记为T1、T2、T3 和 T4。稀释方法：将样品稀释为 50IU/ml，取此溶液 1.0ml 于 25ml 容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，得 2.00IU/ml 样品液。2.00IU/ml 0.180IU/ml1.820ml缓 冲 液样 品0.180IU/ml IU/ml35
15、6缓 冲 液样 品0.180IU/ml 0.101IU/mll.4缓 冲 液样 品0.180IU/ml 0.076IU/ml3702缓 冲 液样 品5.2.14.2.2.3 准备 18 支试管，T 1、T2、T3 和 T4 表示为检测样品，S1、S2、S3 和 S4 表示参照品，A 01、A02 作为空白，按A01，S1，S2，S3，S4，T1，T2，T3，T4， T1、T2、T3，T4，S1，S2，S3，S4，A02 的顺序每支管中加入抗凝血酶 R1 参照品溶液 50l，分 别加入检测样品液或参照品液或三羟甲基氨基甲烷的氯化钠缓冲液(pH 7.4)（检测空白）50l，用相同方法检测空白开始时
16、和结束时的吸收度，两次空白检测的吸光度相差不超过0.05 。每一支加完后，混合但不能产生气泡。5.2.14.2.2.4 在 370.2下保温 1min，每支管加入牛抗 Xa R 参照品液 100l，保温 1min，加入显色底物 R1250l。在370.2准确保温 4min，最后加入 30%乙酸溶液 375l。5.2.14.2.2.5 移取反应混合液至半微量比色皿在 405nm 处以 30%的乙酸溶液为参比，用紫外可见分光光度计检测吸收度，A 01与 A02 的吸光度不得有显著差异， 应在 1 小 时内检测。5.2.14.2.2.6 结果计算：使用中国药典生物检定统计程序 BS2000 软件计算
17、得出样品的抗 Xa 因子含量。平均可信限率 FL %应小于 15%。5.2.14.3 抗 Fa 因子活性检测：5.2.14.3.1 检测抗 Fa 反应原理 低分子肝素（LMWH）+抗凝血酶（AT 过 量） 低分子 肝素抗凝血酶的复合物（LMWH-AT） 低分子肝素抗凝血酶复合物（LMWH-AT）+Fa (Fa过量) LMWHATFa +Fa ( 剩余) 显色底物 R2（S-2238） 肽（peptide）+PNA ）F剩 余( PNA 在 405nm 处有光吸收特性。5.2.14.3.2 检测5.2.14.3.2.1 标准液的配制根据原标准液的抗 IIa 因子的浓度（31IU/安瓶），加超纯水
18、1ml 配成约含 31IU/ml 贮备液，使用之前用 pH 7.4 的缓冲液稀释成 0.070IU/ml、0.042IU/ml、0.025IU/ml 、0.015IU/ml四个浓度的对照液，分别记为 S1、S2、S3 和 S4。稀释方法：取 31IU/ml 标准品溶液 0.0962ml 于 25ml 容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，得 0.119IU/ml 标准液。0.119IU/ml 0.070IU/mlml70.1缓 冲 液标 准 品0.070IU/ml 0.042IU/ml23缓 冲 液样 品0.070IU/ml 0.025IU/ml l.5缓 冲 液标 准 品0.070IU/ml 0.0
19、15IU/ml309缓 冲 液标 准 品5.2.14.3.2.2 样品溶液的配制：首先估测样品的抗 FIIa 因子含量（IU/mg），根据估 测样品的抗 FIIa 因子含量将样品用 pH 7.4 的缓冲液稀释成相应抗 FIIa 四个浓度的检测液，分别记为 T1、T2、T3 和 T4。稀释方法：将样品溶液稀释为 13.5IU/ml，取此溶液 1.0ml 于25ml 容量瓶中，加纯化水稀 释至刻度，得 0.54IU/ml 样品液。0.54IU/ml 0.07IU/mlml940.1缓 冲 液样 品0.070IU/ml 0.042IU/ml 23缓 冲 液样 品0.070IU/ml 0.025IU/
20、ml 7l.5缓 冲 液样 品0.070IU/ml 0.015IU/ml 039缓 冲 液样 品5.2.14.3.2.3 准备 18 支试管，T 1、T2、T3 和 T4 表示为检测样品，S1、S2、S3 和 S4 表示参照品，A 01、A02 作为空白，按A01，S1，S2，S3，S4，T1，T2，T3，T4， T1、T2、T3，T4，S1，S2，S3，S4，A02 的顺序，每支管中加入抗凝血酶R 2 参照品溶液 50l，分别加入检测样品液或参照品液或三羟甲基氨基甲烷的氯化钠缓冲液(pH 7.4)（检测空白）50l，用相同方法检测空白开始时和结束时的吸收度，两次空白检测的吸光度相差不超过0.
21、05 。每一支加完后，混合但不能产生气泡。5.2.14.3.2.4 在 370.2下保温 1min，每支管加入人凝血 酶 R 参照品液 100l，在 370.2下准确保温 1min，加入显色底物 R2250l，在 370.2下保温准确保温 4min，加入 30%乙酸 375l。5.2.14.3.2.5 移取反应混合液至半微量比色皿在 405nm 处以 30%的乙酸溶液为参比，用紫外可见分光光度计检测吸收度，A 01与 A02 的吸光度不得有显著差异， 应在 1 小 时内检测。5.2.14.3.2.6 结果计算：使用中国药典生物检定统计程序 BS2000 软件计算得出样品的抗 IIa 因子含量 。平均可信限率 FL%应小于 15%。5.2.14.4 计算样品干品抗 Xa 因子含量和抗 IIa 因子含量及置信限范围，计算公式：样品干品活性= ； 样品干品活性置信限=干 燥 失 重湿 品 活 性1干 燥 失 重湿 品 活 性1
