1、高效液相色谱仪使用浅析泰鸽安全科技有限公司分析检测中心,泰鸽安全科技有限公司,高效液相色谱法,概 述高效液相色谱法的发展在所有色谱技术中，液相色谱法（liquid chromatography，LC）是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，这种分离效率高、分
2、析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。 气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。现在，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱，位居色谱法之首。,高效液相色谱法的类型,广义地讲，固定相为平面状的纸色谱法和薄层色谱法也是以液体为流动相，也应归于液相色谱法。不过通常所说的液相色谱法仅指所用固定相为柱型的柱液相色谱法。 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色
3、谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。其实，有些液相色谱方法并不能简单地归于这四类。表1列举了一些液相色谱方法。按分离机理，有的相同或部分重叠。但这些方法或是在应用对象上有独特之处，或是在分离过程上有所不同，通常被赋予了比较固定的名称。,高效液相色谱法的类型,高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度510m。适用于分离分子量20010
4、00 的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。,高效液相色谱法的类型,2.液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。 涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
5、,高效液相色谱法的类型,液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。 正相色谱法采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC 在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整
6、个HPLC 应用的80%左右。,正相色谱法与反相色谱法比较表,高效液相色谱法的类型,3离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。,高效液相色谱法的类型,4离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大
7、，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。,高效液相色谱法的类型,5排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。,表1 HPLC按分离机理的分类,HPLC在不同领域的主要应,HPLC几乎在所有学科领域都有广泛应用，可以用于绝大多数物质成分的分离分析，它和气相色谱都是应用最广泛的仪器分析技术，HPLC在部分领域的主要分析对象物质列于表2,表2
8、HPLC在各领域的主要应用,高效液相色谱法的流程,液相色谱仪流程图,2,1,4,5,6,7,3,流动相容器,高压输液泵,进样器,色谱柱,检测器,工作站,废液瓶,液相色谱仪工作流程,现在的液相色谱仪一般都做成一个个单元组件，然后根据分析要求将各所需单元组件组合起来。最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统（记录仪、积分仪或色谱工作站）。 液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入,流动相将样品带入色谱柱,在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据
9、系统记录、处理或保存。,液相色谱分离模式的选择,分离方式是按固定相的分离机理分类的，选定了固定相（色谱柱）基本上就确定了分离方式。当然，即使同一根色谱柱，如果所用流动相和其它色谱条件不同，也可能成为不同的分离方式。选择分离方式大体上可以参照图3,高效液相色谱法的运用范围,气相色谱法适用于分析相对分子质量较小，容易挥发成气体的物质。 气相色谱法控制温度可达300，热稳定性差的物质在此温度下将发生分解，但高沸点物质在此温度下也不能完全气化 高沸点、热稳定性差的有机化合物、以及相对分子质量大(大于400)的有机物(约占有机物总数的70%80%)，均不宜应用气相色谱法进行分析，但可以应用高效液相色谱法
10、进行分析。,高效液相色谱法的运用范围,高效液相色谱法在常温下进行分离与分析，不会导致被测物质的热分解，其流动相是液体，所以只要试样能制备成溶液，原则上都可以用高效液相色谱法分离与分析，如离子型化合物、不稳定天然产物以及氨基酸、蛋白质等高分子化合物均可用高效液相色谱法获得较好的分离效果。,高效液相色谱法的运用范围,高效液相色谱分离方法的选择 选择的基本依据 相对分子质量的大小： 对于相对分子质量在200以下、易挥发、热稳定性好的化合物，可采用气相色谱法； 相对分子质量在2002000的化合物，可用液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法 相对分子质量大于2000的试样，适宜用凝胶色谱法进行分离
11、,高效液相色谱法的运用范围,试样的溶解性 能迅速溶于水的样品，可采用反相液-液色谱法； 若试样全部或大部分能溶于HCl或NaOH溶液，表示试样属于离子型化合物，可采用离子交换色谱法来分离； 溶于非水溶性溶剂(如己烷、异辛烷、苯、甲苯等烃类)的试样，可选用液-固吸附色谱法3溶于二氯甲烷或三氮申烷的试祥，选用常规的液-液色谱(正相色谱)法和吸附色谱法； 溶于甲醇等溶剂的试样，则可以用反相液-液色谱法进行分离与分析。,液 相 色 谱 分 析,主 要 液 相 色 谱 方 法 特 性,液 相 色 谱 分 析,次 要 液 相 色 谱 方 法 特 性,步 骤,准备,开机,清关 洁机,分测析试,LC-15C系
12、统组成,本系统由LC-15C送液单元 CTO-15C柱温箱 SPD-15C紫外可见双波长检测器 色谱数据工作站和电脑等组成，另外还包括打印机、不间断电源等辅助设备。,LC-15C液相色谱仪,第一步 准 备,1 、准备所需的流动相，用合适的0.45m滤膜过滤，超声脱气20min。 2 、根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定量环。 3、 配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的0.45m滤膜过滤。（注意：滤膜有水性与有机两种，选择合适的） 4 、检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正。,第二步 开 机,检查仪器各部件。 打开仪器电源开关、泵和检测器开关。泵和检
13、测器自检结束后，打开电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站,第三步 分析测试,（一）设置参数 1、 波长设定： 2 、流速设定： 3 、流动相比例设定： 4、 梯度设定：,（二）更换流动相并排气泡,1： 将吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中；2 ：顺时针转动泵的排液阀180，打开排液阀；3 ：运行泵，泵以3ml/min的流速冲洗5min（可设定）后泵流速设为0ml/min；4 ：将排液阀逆时针旋转适度拧紧，关闭排液阀。5 ：如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。,（三）平衡系统,检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。 观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过1MPa。如超过则
14、可初步判断为柱前管路仍有气泡，按检查管路后再操作。用检验方法规定的流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积的流动相。 观察基线变化。如果冲洗至基线漂移0.01mV/min，噪声为0.001mV时，可认为系统已达到平衡状态，可以进样。,（四）进 样,1 、进样前按检测器balance键调零，按软件中 零点校正 按钮校正基线零点，再按一下 查看基线 按钮使其弹起。 2 、用试样溶液清洗注射器，并排除气泡后抽取适量即可进样了。 3、测定的对照溶液和样品供试溶液每份至少注样2次 。,（五）谱图的判断及结果计算,1、系统适用性实验：分离度：一般应1.5。重复性：两次谱图的峰面积应相差不的过1%。理论塔板数：
15、应规定的理论塔板数目。拖尾因子：0.95T1.05保留时间：对照与样品的主成分保留时间应大致一致。RSD： 精密度3% 。 2、结果计算外标法 内标法,第四步 清洗管路及关机,1、分析完毕后，先关检测器，再用经滤过和脱气的适当溶剂清洗色谱系统，正相柱一般用正已烷，反相柱如使用过含盐流动相，则先用水（5%甲醇），然后用甲醇-水冲洗，各种冲洗剂一般冲洗1530分钟，最后用甲醇保留色谱柱，特殊情况应延长冲洗时间。 2、 冲洗完毕后，逐步降低流速至0，关泵，进样器也应用相应溶剂冲洗，可使用进样阀所附专用冲洗接头。 3 、关断电源，作好使用登记，内容包括日期、检品、色谱柱、流动相、柱压，使用小时数，仪器
16、完好状态等。,注意事项,（一）流动相由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力， 并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影 响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选 择性。（2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意 选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫 外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此 辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严 重干扰组分的吸收测量。,常用流动相的紫外截止波长,注意事项,（3） 高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基
17、线不稳，或产生“伪峰” 痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50100nm。（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。（5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离.,注意事项,（二）色谱柱 1.流动相或溶剂的化学腐蚀性不能太强. 2.避免样品微粒在柱头沉积. 3.防止过高压力冲击色谱柱. 4.流动相pH大于7时要使用保护柱. 5.正确制备样品,在样品注射器前加装针式过滤器. 6.色谱柱不用卸下前: a.必须洗去缓冲液. b.防止产生微生物 c.用
18、大于10%的有机溶剂充满整个色谱柱. d.柱卸下后用柱堵头将色谱柱首尾密封.,必须做! 溶剂和水的前处理：过滤,设备和材料：溶剂过滤器、真空泵、0.45u或更 细的水性滤膜和有机滤膜 过滤的方法：用加了滤膜的溶剂过滤器和真空泵 抽滤 过滤的目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞 色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。,必须做! 溶剂和水的前处理：脱气,脱气的目的：使色谱泵的输液准确输液均匀准确，且脉动减小。保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化,整台液相色谱仪的维护,1.在使用过含盐缓冲液后必须
19、清水冲洗泵15分钟，此时 必须打开排放阀，不能使废液进入色谱柱。 2.关上排放阀，用90%+10%的水、甲醇溶液冲洗整个系 统，时间为1520分钟，流量1ml/分。本步骤主要是冲 洗干净系统内其他含盐的部位。 3.用纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为 1ml/分。本步骤主要是保护色谱柱。 4.如果未使用缓冲液，上面1、2两步骤可免去，直接用 纯的强溶剂冲洗整个系统，时间为1小时，流量为1ml/分。,每次用过仪器后必须做!,紫外检测器,每次做 1.流过池每次使用后连同色谱柱一起清洗. 2.使用脱过气的流动相,防止气泡卡在流过池内. 经常做 3.不定期的用强溶剂反向冲洗流过池(拆开柱子). 4.不定期的使用空流过池校正波长. 根据情况定 5.在流过池出口加装背压阀.,操作极限预防,1.严禁在无流动相时启动高压输液泵. 2.设定泵的上限压力(25Mpa)防止长期压力过高 损坏泵和进样阀.3.设定泵的下限压力(0.51Mpa)防止流动相抽干 和严重泄漏.,The End,Thanks!,
