1、1一前期对一些重要试剂用量的评估（以 mRNA 100ng 为计算标准）1.如果原材料 0.2g（约 5 株 2 周苗期的苗），分成两管，每管 0.1g，则分别加 TRIzol 2ml（共 4ml），也就是说，每个生物 样品作两次生物重复的 话。每瓶 TRIzol 有100ml，所以可以做 25 个材料。2.一个材料作二次生物重复，需要 4 根 Zymo RNA 纯化柱。一个标准 Zymo Kit 有100 个反 应柱子，也就是可以做 25 个材料。3.RNA fragmentation 完整 Kit 可以做 100 个样品。4.mini/midi Kit 可以做 12 个柱子反应。二前期准备
2、工作1.DEPC 处理的 Rnase free 水；2.RNA 专用的 75%乙醇、异丙醇、三氯甲烷和 NaOAc；3.220烘烤6 小时的研磨棒、器皿和药匙；4.足够的液氮；三其它小知识理论上，每 100mg 材料可以获得 100-200ug total RNA，纯化后获得的 mRNA 的量约为 total RNA 量的 1/100。四具体实验步骤（一）TRIzol 提取总 RNA1先将研磨棒等用液氮预冷，然后加液氮粉碎叶片（组织），越细越好。2准备好 TRIzol 管，每 50-100mg 材料加入 1mlTRIzol（材料体积应小于2TRIzol 体积的 10%），振荡或用移液器打至无大
3、颗粒（震 荡 2 分钟可）。3悬液室温放置5min( 可 30min 放置) 。再加入 1/5V（起始体积）氯仿，剧烈振荡 1-2 分钟，室温放置 5min。然后 13000rpm 2-8 离心 30 min。4吸取无色上清（约有 1/2 的起始体积量），加入 1/2 V（起始体积）异丙醇。室温放置 10 min。然后 13000rpm 2-8 离心 30 min。5弃上清液。沉淀物以 75%乙醇洗涤（1ml 乙醇/1mlTRIzol）。然后13000rpm 2-8 离心 10min。6空转一次，吸去上清。7适当干燥 5 min。加入经 DEPC 处理的 Rnase free 水 100ul，
4、冰浴 1 小时。8检测：2l 电泳检测，另取 1l 稀释 10 倍后测 OD 值。9【用 RNase free 的 Dnase 酶切。 （一般 100ug 的总 RNA 中加 4%-5%V 的RNase inhibitor 和 10-20U 的 Dnase，然后 37 30 min）。】10 如果暂时不用，可以加 1/10V 的 3M PH5.5 的 NaOAc 和 3V 体积无水乙醇，-80放置 2 小时以上或 overnight。然后 12500rpm 2-8 离心15 min，重复 step 5-7。（二）从总 RNA 提取 mRNA（Oligotex mRNA Midi Kit）（RE
5、PEAT）(NOTE: Oligotex、OBB 先 37预热，然后振 荡， 25备用。OEB 70预热。)1根据以下表格依次混合在 1.5ml 微离心管内。 须充分混合。total RNAadd Rnase-free water to total RNA sample:Buffer OBB(l) Oligotex Suspension(l)10000 rpm 离心 1 min。2. 然后加 350l Wash Buffer 至离心柱， 以10000 rpm 离心 1 min。重复此步骤。3. 再以 10000rpm 空转离心 1 min。4. 将此小离心柱换入新的 Rnase-free 的
6、1.5ml 微离心管内。用 43l Rnase-free Water 洗脱，放置 1 min 后以10000 rpm 离心 1 min；重复此步骤，最后为 86l。5. 取 1l 电泳检测，另取 1l 稀释 10 倍后测 OD 值 。6. 加 1/10V 的 3M PH5.5 的 NaOAc 和 3V 体积无水乙醇，-80 30min-2 小时。7. 10000rpm 4离心 30min，弃上液，加 75%乙醇 400ul 洗，再 10000rpm 4离心 3min，弃上液，适当晾干 5min，溶解于 9ul Rnase free 水中（冰浴4放置 30min-2 小时）。（四）mRNA fr
7、agmentation1. 将 9ul 的 mRNA 样品转移到 200ul PCR 专用 tube 管中，再加10XFragmentation Buffer（Ambion，#AM8740）1ul，放置于 PCR 仪 70 度 5 分钟。2. 加入 1ul Stop Buffer（Ambion，#AM8740），立即置于冰上。3. 转移到 1.5ml 的 tube 管中，依次加入 1ul 3M NaOAc（PH5.2），2ul glycogen（Ambion，#AM9510），30ul 100% EtOH，-80 度放置 30 分钟。4. 以 14000rpm 4 度离心 25 分钟沉淀，弃上
8、液，加 75%乙醇 400ul 洗，再10000rpm 4离心 3min，弃上液，适当晾干 5min，溶解于 10.5ul Rnase free水中（冰浴放置 30min-2 小时）。（五）First strand cDNA synthesis1. 将 10.5ul 样品转移到 200ul PCR 专用 tube 管，然后加入 1ul Random Hexamer Primers（3ug/ul，Invitrogen，#48190-011），在 PCR 仪 65 度放置 5 分钟，立即置于冰上。2. 准备以下的 mixture，充分混合，保证能提供 7.5ul mixture 至一个样品。依次
9、5X first strand buffer（Invitrogen，#18064-014）4ul；100mM DTT（Invitrogen，#18064-014）2ul；dNTP mix（10mM）1ul；RnaseOUT（40U/ul）（Invitrogen，#10777-019）0.5ul3. 将 7.5ul mixture 加入样品中，充分与 样品混合，25 度放置 2 分钟。4. 加 1ul SuperScript II（200U/ul，Invitrogen，#18064-014）到样品中，按以下程序依次加热或置冷：25 度 10 分钟-42 度 50 分钟-70 度 15 分钟-4
10、度 hold（以上每个样品实际量为 20ul）5（六）Second strand cDNA synthesis1. 直接在样品加入 51ul 水。2. 依次加入 5XSecond strand buffer（Invitrogen，#10812-014）20ul，dNTP mix（10mM）3ul，充分混合，再冰上放置 5 分钟。3. 加入 RNaseH（2U/ul，Invitrogen，#18021-014）1ul，DNA Pol I（10U/ul，Invitrogen，#18010-025）5ul，充分混合，在 PCR 仪 16 度放置 2.5 小时。（以上每个样品实际量为 100ul）4. 进行样品 DNA 纯化（Qiagen ，#28106）：即每个样 品中加 500ul PB，转入柱子中，12500rpm 离心 1 分钟，弃去下液，柱子中加 750ul PE，12500rpm 离心 1分钟，弃去下液，再空转 1 分钟，放置 1 分钟，柱子换入新的 tube 管中，加入 16ul EB 洗脱，再加入 16ul EB 洗脱第二次.5. 各取 2ul 测 OD 值。样品后续交给测序组，用 Illumina Genomic DNA Sample Prep Kit（#1000181）继续样品制备，上样测序。
