1、虎纹蛙骨髓细胞染色体标本的制备及其染色体核型分析赖标汶（中山大学生命科学学院 08 级生态学 广州 510275）摘要：采用虎纹蛙的骨髓细胞制作了虎纹蛙的染色体标本后，利用 Photoshop 和 Excel 等软件对其进行核型分析。核型分析时，通过计算染色体的相对长度、臂指数、着丝粒位置等三个重要参数，采用 Levan 标准，对虎纹蛙的染色体进行类型分类。最后按染色体的大小和类型，配对排列后即得到虎纹蛙染色体的核型。结果表明，虎纹蛙的染色体组型为K（2n=26）=12m+14sm。关键词：染色体标本；核型分析；虎纹蛙；Photoshop 软件引言核型（karyotype）是指一个细胞内的整套
2、染色体按照一定的顺序排列起来构成的图像。通常是将显微镜摄影得到的照片染色体照片剪贴而成，可以借助 Photoshop 软件进行分析。正常细胞的核型能代表个体的核型。核型的研究对人类医学遗传研究及临床应用，对探讨动植物起源、物种间亲缘关系，鉴定远缘杂种等方面都有重大意义。 11 材料与方法1.1 材料虎纹蛙 （中山大学细胞生物学实验室提供）1.2 试剂Carnoy 固定液（甲醇：冰醋酸=3：1） ，0.1%秋水仙素溶液， 0.65%生理盐水，1/15mol/L 磷酸缓冲液（pH=7.4 ） ，Giemsa 染液。1.3 方法（1）实验前 34h，按虎纹蛙每克体重 24ug 的剂量，腹腔注射秋水仙
3、素。（2）处死虎纹蛙后，立即取出股骨，用刀剔掉肌肉。（3）用刀片切开股骨的两端，用盛有生理盐水的注射器插入股骨的上端，冲出骨髓细胞至离心管中，直至股骨变白位置。将收集的骨髓细胞平衡后放入离心机，以 1000r/min 离心10min。（4）离心后，弃上清液，加入 6ml 蒸馏水，用吸管轻轻吹打成细胞悬浮液，低渗 20min。（5）加入 5 滴新配的固定液，立即打匀，并以 1000r/min 离心 10min 后，弃上清液。（6）沿管壁慢慢加入 6ml 固定液，立即用吹管吹打成细胞悬浮液，室温下固定20min。1000r/min 离心 10min 后弃上清液。（7）重复步骤 6 的操作。（8）沉
4、淀物中加入 0.30.5ml 固定液，用吸管吹打成细胞悬液。（9）用镊子取预先冰冻的干净载玻片，迅速滴上 23 滴细胞悬浮液，立即用嘴向同一方向吹气，使细胞分散均匀，然后置酒精灯上微微加热干燥。（10）将晾干的玻片放在洁净的玻板上，用 Giemsa 染液染色 30min，自来水冲洗，空气干燥。（11）在显微镜下用低倍镜找到中期分裂相的细胞，转用高倍镜，选择染色体分散适度、长度适中的分裂相进行观察。并拍照。（12）用 Photoshop 对照片中的染色体进行剪切、分离、配对。先目测配对。（13）用 Photoshop 的测量工具，测量每条染色体短臂和长臂长度，计算出各条染色体的相对长度、着丝粒指
5、数、臂指数，并记录原始数据。（14）根据测量数据校正目测配对排列的结果，进行调整排列。（15）把染色体按照一定顺序一对一地排列，按照从大到小，短臂向上，长臂向下，性染色体单独排列的规则排列，最后整成一张完整的染色体核型图。2 实验结果2.1 虎纹蛙染色体数选择合适的破裂细胞，在显微镜下观察计数知，染色体数目为 2n=26 的细胞占绝大多数，少数小于 26 的细胞是染色体在标本制备过程中缺失了。所以，虎纹蛙的染色体数目为2n=26。图 1 是本实验的实验结果（由实验老师提供） 。图 1 虎纹蛙骨髓细胞染色体（05 级中医班同学制作的标本）图 2 是本人实验的实际结果，由于染色体分离不开，且染色体
6、歪曲变形，难以进行染色体核型分析，弃用。图 2 虎纹蛙骨髓细胞染色体（本人实验实际所得）2.2 染色体核型分析2.2.1 虎纹蛙染色体的核型图根据图 1，用 Photoshop 进行染色体的配对和一定顺序的排序，得到虎纹蛙的核型图 (图 3)。图 3 虎纹蛙染色体的数目和核型图（依据图 1 分析）2.2.2 虎纹蛙染色体的特征依据染色体核型图和表 1（附录在后）的数据。（1） 有 5 对大型染色体（染色体相对长度9）和 8 对小型染色体。按照 Levan 标准，依据着丝粒指数和臂指数，对染色体进行分类，其中第 1、5、6、8、12 和 13 对共 6对染色体为中部着丝粒染色体（m ） ，而第
7、2、3、4、7、9、10 和 11 对共 7 对染色体为亚中部着丝粒染色体（sm） 。没有亚端部着丝粒染色体（st ） ，没有端部着丝粒染色体（t） 。虎纹蛙染色体核型为 K（2n=26）=12m+14sm。（2） 第 6 对染色体的长臂有明显的次缢痕。这是虎纹蛙的一个染色体特征。但是没有发现端粒、随体等。（3） 没有发现明显的异型性染色体存在，染色体都可以配对。没有雌雄对照，难以判断雌雄。而实际上，依据章菊明等人对虎纹蛙的研究，虎纹蛙没有异型性染色体存在。2表 1：虎纹蛙骨髓细胞 13 对染色体分析数据染色体的对数 短臂 长臂 染色体长度 相对长度(%) 臂指数着丝粒指数(%)着丝粒位置1
8、8.48 9.985 18.465 14.14 1.177 45.925 m2 5.76 10.14 15.9 12.18 1.76 36.226 sm3 5.155 9.045 14.2 10.87 1.755 36.303 sm4 4.37 9.195 13.565 10.39 2.104 32.215 sm5 5.42 6.645 12.065 9.24 1.226 44.923 m6 3.53 5.67 9.2 7.04 1.606 38.37 m7 2.915 5.25 8.165 6.25 1.801 35.701 sm8 3.23 3.995 7.225 5.53 1.237 4
9、4.706 m9 2.69 4.845 7.535 5.77 1.801 35.7 sm10 2.025 4.485 6.51 4.98 2.215 31.106 sm11 1.985 4.19 6.175 4.73 2.111 32.146 sm12 2.495 3.34 5.835 4.47 1.339 42.759 m13 2.415 3.34 5.755 4.41 1.383 41.964 m图 4 虎纹蛙核型中 13 对染色体的对称性（依图 3 的染色体排序次序）3.实验讨论（1）本实验采用蛙的骨髓细胞，是因为骨髓细胞有丰富的细胞质和高度分裂能力，因此不必经体外培养，也不需要植物血球
10、凝集素的刺激，可直接观察到分裂细胞。再经秋水仙素处理后，就被阻断在有丝分裂的中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可制作出理想的染色体标本。（2）要进行染色体核型分析，能否得到分散开、不重叠、不严重扭曲染色体，标本制备很关键。步骤 9，在干净载玻片上滴细胞悬浮液的高度，会影响标本制备效果。如果没有经验，很可能会下落高度不够，导致细胞摔落在载玻片时不破裂，或者破裂，染色体仍然没有很好的分散。对玻片吹气使细胞均匀分布这一步骤也是不能缺少的，否则细胞太密，仍是不易观察。（3）染色后水洗的程度要把握好，染色太淡，染色体界限不清楚，不易进行核型分析染色体的分离和测量。（4）在 Photoshop 进
11、行照片处理时，也要注意一些细节的技术问题。比如，采用魔术橡皮擦工具时，要注意设定好“容差”项，多次尝试，选择最佳的效果。本实验的照片，采用的容差是 15，能很好的保留染色体的原状。(5)染色体的数目、类型到次缢痕等跟物种有一定的对应关系，可以作为细胞分类学上具有一定价值的形态学标记。 2(6) 染色体的核型、类型等也是表明该种系统演化位置以及和相近种亲缘关系的重要依据。一般认为，核型进化的基本趋势是由对称向不对称发展的，系统演化上处于比较古老或原始的植物，大多具有较对称的核型，而不对称的核型则常见于衍生的、特化的以及比较进化的植物类群中。 3虎纹蛙的核型对称性好（图 4） ，说明其比较原始。参
12、考文献1王金发、何炎明.细胞生物学实验教程.2004 年 9 月第一版 .北京：科学出版社，2004.9:83-85，91-93.2 章菊明; 王爱华; 郭平. 虎纹蛙的染体组型J. 温州医学院学报,1984,(01).3 黄俊; 赵应学; 刘喜华; 王建. 广西莪术染色体的核型分析 J. 安徽农业科学,2010,(28)The marrow cell chromosome preparation and karyotype analysis of Rana tigrinaAbstrac: Use of marrow cells produced frog Rana tigrina chrom
13、osome samples, and then use of Photoshop and Excel to finish karyotype analysis. Karyotype analysis, by calculating the relative chromosome length, arm index, location of the centromere. Use of Levan standards to classify chromosomes. Finally, according to the size and type of chromosome, pair chrom
14、osome of Rana tigrina to do karyotype. The results showed that the karyotype of tiger frog was K (2n = 26) = 12m +14 sm.Key words: chromosome preparation；karyotype analysis；Rana tigrina；Photoshop青蛙骨髓细胞染色体标本的制备及其染色体核型分析樊代佳（中山大学生命科学学院 08 级生态班 广州 510275）摘要：本实验采用骨髓细胞染色体标本制作法，以青蛙骨髓细胞为材料制作了染色体标本，并在显微镜下拍摄采
15、集染色体电子图片，后期用 Adobe Photoshop CS4 软件处理图片以获得配对的、清晰的且完整的青蛙染色体核型图。编码、测量、记录每对染色体的相对长度，再按照 Levan 法 1通过计算所得的臂指数与着丝粒指数将其分组、命名。得到的实验结果为，青蛙细胞染色体数为 26 条即 13 对，包括 5 对大型染色体（相对长度9%）和 8对小型染色体（相对长度9%）和 8 对小型染色体（相对长度9%）和 8 对小型染色体（相对长度14.0%） ，臂指数在大型染色体中最小即着丝点最接近中央；B（25）组：属于中部和亚中部着丝粒染色体的 4 对大型染色体，第 2、3 对相对长度较大，其余较小；C（
16、613）组：包括 8 对小型染色体，除第 8 对为亚中部着丝粒染色体其余都为中部着丝粒染色体。四、讨论1. 数蛙属两栖类的染色体组型中，染色体数都为 26 即 13 对，包括 5 对大型染色体及 8 对小型染色体 4，本实验的结果显示符合这一典型标准。2. 制作染色体标本过程中，低渗处理是实验成败的关键，其目的在于使细胞处于低渗溶液中从而涨大，染色体松散。处理时间太长会使细胞破裂，染色体过度分散或丢失；而处理程度不够则使染色体仍旧曲结成团，无法对其进行统计与分析。3. 制作染色体标本最后的染色也很重要，染色、脱色效果较好会使染色体与背景较易区分，从而获得更为清晰的染色体图片，为后续的处理分析做
17、好铺垫。4. 经典的核型分析方法是用显微摄像机将核型拍摄，洗出照片后用剪刀将各染色体剪下，然后分组、排序、粘贴、复拍，最后才制成核型分析的照片进行进一步的研究。而本实验采取利用 Adobe Photoshop 软件对照片进行后期处理，相对更为简单、省时、易于操作。5. 本实验对不同性别青蛙个体的染色体核型分析不够彻底和精确，要确定性染色体的结构特点，须进行进一步的研究。参考文献1 Levan A, Fredge K, Sangberg A A. Normene latrure for contromeric position on chromosomes. Herditas,1964,52,2
18、01-220.2王金发. 细胞生物学第一版. 科学出版社，2008，497498.3王金发，何炎明. 细胞生物学实验教程. 科学出版社， 2010，91.4李炳华，汪尊德. 棘胸蛙的染色体组型分析. 遗传，1983 ，5（5）：39-41.The marrow Chromosome specimen preparation and karyotype analysis of the frog Rana tigrinaEcology department of life science school, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, Daiji
19、a FanAbstract: The Chromosome specimen needed for karyotype analysis is made from the marrow cells of the frog. To get the paired and completed clear caryogram, the pictures of the Chromosome is successively processed by a software called Adobe Photoshop CS4 while taken by the microscope camera. The
20、n the relative length of every pair of the Chromosome is measured and recorded to name and group them according to their brachial indexes and centromere indexes referring to the Levans method. It turns out that the diploid Chromosome number is 26, including 13 pairs5 large pairs( relative length9%)
21、and 8 small pairs( relative length 14.0，极易区分。2.3.2 B组（25号染色体），相对长度9. 0 14. 0, ，全为中部着丝粒染色体。2.3.3 C组（613号染色体），为小型染色体，相对长度4)和 8 对小型染色体 (相对长度4） ，小型染色体有 8 对(相对长度4)，and eight pairs of which are small chromosome(relative length4). The chromosomal karyotype formula of frog was 2n= 26=20m+4sm+2st, NF= 52 in the body cell of frog. This experiment failed to frog sex chromosomes for analysis.Key words: frog; marrow cells; chromosome; karyotype
