1、1动 物 实 验 申 请 表1. 项目名称: 哈药马脂对大鼠关节僵硬治疗机制的研究2. 申请单位：新疆医科大学第一临床医学院暨第一附属医院骨科中心暨骨科研究所运动医学研究室3. 项目负责人(导师)：徐小雄 职称：主任医师 联系方式：135792108254. 课题负责人：加莎热特杰力勒 单位：骨科研究所运动医学研究室联系方式：13579210825 邮箱：5. 课题组成人员资料: 请填写实际参与动物实验人员的资料（表 1） 。姓 名 职称 参与动物实验期限参与动物实验相关技术与经验时间健康状况 过敏史 签名加莎热特 副主任医师硕士研究生导师3 个月 10 年 健康 无 加莎热特尹作祯 硕士研究
2、生3 个月 半年 健康 无 尹作祯康辉 硕士研究生3 个月 半年 健康 无 康辉王贵胜 硕士研究生3 个月 半年 健康 无 王贵胜武玉福 硕士研究生3 个月 半年 健康 无 武玉福姜涛 兽医 3 个月 7 年 健康 无 姜涛6. 课题来源(国际合作、国家、自治区级、院内等): 自治区级课题名称：哈药马脂对大鼠关节僵硬治疗机制的研究课题属性(研究生、博士、博士后，其他)：研究生7. 课题经费来源: 自治区自然科学基金资助项目2项目编号：200821115 资助金额：90000.000 元8. 动物实验起始日期 : 2008-5-1 结束日期：2008-8-19. 以往动物研究项目名称： 新西兰白
3、兔跟腱断裂模型的生物力学实验研究 运动对兔跟腱断裂术后差异蛋白表达的影响10. 实验动物品种品系：SD 大鼠 数量：70 来源：新疆医科大学实验动物中心 等级：普通 SD 大鼠 70 只 其中 10 只作预实验。11. 动物模型名称，是否需要实验动物科学研究部提供疾病动物模型， （否）请详述。12.动物的造模手术是否为复合性重大手（否） ，如是，请在动物疾病模型介绍中阐明其必要性13. 动物实验将要在实验动物科学研究部（ 显微外科手术室 ）进行14. 动物模型名称（SD 大鼠胫腓骨骨折闭合复位石膏外固定术后膝关节僵硬模型） ，是否需要实验动物科学研究部提供疾病动物模型，请详述。否15. 动物模
4、型是复制还是创新，若创新请详述创新点（参照国外、国内已有模型） 。参照国内已有模型： 俞力行，张友定，姜宏.熏洗方对大鼠骨折后期僵硬关节滑膜型胶原mRNA 及 TGF-1 表达的影响.中医正骨杂志，2005，17（1）：7-8. 张友定，俞力行，陈建华.薰洗方对大鼠骨折后期僵硬关节滑膜型胶原 mRNA 及 MMP1 活性的影响.中国中医骨伤科杂志，2005，13（2）：10-12.） 。在本实验动物中心首次运用。16. 模型制作预期结果：探索（ ） ；走向市场（ ） ；17. 是否需要实验动物科学研究部给予指导和协作是否需要兽医指导、配合：是是否需要护士配合： 否18. 动物实验使用设备名称
5、：显微镜19. 该项目是否必须用该种实验动物进行实验，能否用计算机模拟、细胞培养等非生命3方法替代动物或用低等动物替代高等动物进行实验，能否通过改良设计方案或用高质量的动物来减少所用动物的数量，请说明理由。该项目必须用实验动物进行实验，因为 俞力行，张友定等学者采用熏洗方对大鼠骨折后期僵硬关节滑膜进行研究，他们采用了 SD 大鼠。 本实验是用 SD 大鼠模拟人胫腓骨骨折闭合复位石膏外固定术后膝关节僵硬，采用哈药马脂僵硬的膝关节，提高关节活动度为哈药马脂治疗僵硬膝关节的机理作出现代生物学解释，探讨哈药马脂经皮渗透，刺激基质金属蛋白酶（MMPS） 、基质金属蛋白酶抑制基因（RECK）等基因，使干预
6、部位 MMPS 活性改变，组织内胶原酶、明胶酶等活性随着改变，胶原转换率减少并被降解，同时在哈药马脂所含维生素 E、A 的协同作用下最终使得僵硬关节的纤维化瘢痕挛缩等得以逆转，回答哈药马脂治疗僵硬膝关节的科学基础，发展运动医学研究。本实验设计方案参照俞力行，张友定等学者的实验方法，动物的数量已经减少到最少。20. 是否需要实验动物科学研究部提供手术衣、裤，手术中使用的器械是否需消毒，如需消毒请备注。需要实验动物科学部提供手术衣、裤，并消毒21. 是否对动物实施放射性物质或 X线照射，请详述。否22. 实验研究是否涉及器官、组织细胞工程移植，请详述。否23. 实验研究是否涉及细胞毒性药物和动物肿
7、瘤模型研究，请详述。否24. 请叙述动物麻醉药品的名称、给药途径、剂量。手术是利用水合氯醛按每 100gSD 大鼠用 3ml 腹腔注射后使大鼠全麻后，术前要做到充分的术前准备：术前要禁食水，术后镇痛：杜冷丁 1mg/1Kg，肌肉注射主要观察动物活动量、动物的警惕性、动物的饮食量等方法来知道动物是否疼痛25.手术方法是如何避免或减轻动物的疼痛和不适感。全身麻醉，动物基本无痛苦、无恐惧。426.请叙述实验中对动物进行固定的目的、方式及时间。全身麻醉下 60 只 SD 大鼠用折骨器人为制造右下肢胫骨骨折创伤，然后将 SD 大鼠右侧膝关节屈曲 90 度，并用石膏外固定固定，固定 4 周。固定期间每天观
8、察动物的饮食量、末梢循环情况、及石膏有无松动因固定后造成动物肌肉萎缩，故给予 10 天，20 天时将石膏全部拆掉重新固定，固定期间动物死亡原因分析：1.将动物尿道用是高封闭，2.石膏固定后因动物啃咬石膏致消化系统问题所致（解剖见动物结肠巨大无法正常笑话食物） 27. 实验后动物是否需要提供场地观察和代养，如需代养，请详述每组每只动物的代养时间，地点，具体要求；如果不在饲养室而在实验室，请详述代养的动物数量，时间，地点，环境及在实验室代养的原因。需代养在实验动物科学研究部鼠房，给予正常饮食喂养。共分 2 组，每组各 5 只，第一组养 7 天，第二组 14 天，第三组 21 天。28. 所进行的实
9、验动物是否具有传染性疾病，详述对人及环境的保护措施，废弃物的处置方法。否29. 请说明动物的术后护理方法。动物的术后护理主要是术肢末梢血运，防止骨胫膜室综合症，必要重新石膏固定。及时清理 SD 大鼠的粪便等排泄物，保持笼舍干燥。30. 请叙述动物发生不良反应时抢救措施。预备相关药物以备心源性休克的抢救，如果 SD 大鼠出现如下肢血运不通畅，应及时拆除石膏外固定，若果出现严重的缺血坏死等情况，必要时给予安乐死31. 请叙述对动物实施安乐死的措施。手术是利用水合氯醛按每 100gSD 大鼠用 3ml 腹腔注射后使大鼠全麻后，术前要做到充分的术前准备：术前要禁食水，颈椎折断。5动物疾病模型介绍（10
10、00 字以上）内容包括：模型国内外概况、本模型制模具体方法（进行动物实验的内容、方法、剂量与步骤） 、模型应用于该课题的技术路线及创新之处，动物伦理委员会将对上述内容进行审核。模型国内外概况：目前膝关节僵硬模型有 10 余种，而本课题组采用俞力行，张友定等学者采用的方法制作 SD 大鼠膝关节僵硬模型。研究方法：1. 动物选择分组选择雄性健康成年普通级本校实验动物中心提供，质量合格证编号：SCXK(新) 2003-0001SD 大鼠共 60 只，同月龄、按国家标准啮齿类动物饲料同一饲料常规喂养，饲养、体重 0.25kg100gSD 大鼠。分组方法为耳标标记，先按 160 编号，再采用随机数字表法
11、选择随机数字，完全随机化分组。模型制作在我新医大一附院实验动物研究中心进行，均实行 12 小时昼夜规律调整，两天后进入实验。2. 模型制作：将右胫骨下端用折骨器致闭合性骨折，然后以膝关节屈曲 900位石膏固定骨折端和膝关节，4 周后拆除固定，造成膝关节僵硬模型，30 例被遗弃。造模成功后，将 SD 大鼠关节僵硬模型随机分为对照组（15 只）、药物组（15 只）6（见表 1)。3. 干预模型：实验组（药物组）6 周后膝关节僵硬部位药物外用经皮渗透。方法：外用药物时：每天涂抹 6 次，间隔大约 2 小时，每次外用时将剪好的纱布浸湿后附于骨折部位，约 10 分钟，每只每次大约 5ml 药物，对照组同
12、样在 4 周后膝关节僵硬部位不用任何药物。表2. 大鼠僵硬关节的两种处理方式组别 N 7天 14天 21天空白对照组 15 5 5 5生物药物组 15 5 5 5T 值P 值4. 模型关节功能评定：对照组和药物组分别在 7 天、14 天、21 天按 Sodergard 关节功能评定标准进行关节功能评定。评价具体方法：用水合氯醛将大鼠麻醉后，将患肢的膝关节，踝关节，患肢远端用红笔标记后用 5g 砝码悬吊在患肢远端后用量角器测量。5. 模型关节滑膜切取： 对照组和药物组分别在 7 天、14 天、21 天按 Sodergard 关节功能评定标准进行关节功能评定后并处死，切取模型膝关节髌上囊周围滑膜组
13、织。 关节滑膜组织切取范围在膝关节内，在显微镜的辅助下切取。滑膜用 4冰生理盐水迅速冲洗 3 次，把周边血去干净，在分析天平上满足 0.5 g 为止。放入冻存管中后立即冻存于液氮罐中，然后放在80低温冰箱保存。系列课题：（1）哈药马脂对大鼠关节僵硬模型关节活动度作用评价及对滑膜组织学观察哈药马脂对大鼠关节僵硬模型关节滑液与关节滑膜差异蛋白峰表达（蛋白指纹图谱、地形图）课题负责人：尹作桢7课题类型：自选本项目系列课题滑液制备地点：新医大一附院医学研究中心实验地点：新医大一附院包研所和新医大一附院检验科实验费用：2500.00 元左右（由自己课题经费支出） 。SD 大鼠关节僵硬模型在每个时间段模型
14、标本与正常组取标本时间及样本含量同本模型（见表 2.）滑液蛋白质与 SELDI 蛋白质芯片阵列结合，通过电离解吸飞行时间质谱仪检测，根据蛋白质的质量和电荷比(质荷比)，每个蛋白质的峰值可形成一个可能的蛋白质生物标志的图谱。研究目标：做： 应用 SELDI 质谱仪测定两种模型每个时间与正常组标本的蛋白质组图谱,分别建立滑液蛋白质的指纹图谱, 并为进一步发现新的导致关节僵硬的标记物提供基础。可以测得标记物的分子量。不做：蛋白质的胶内酶解和质谱鉴定、生物信息学检索关节滑膜实验地点：新医大地方病分子生物学实验室（2）哈药马脂对大鼠关节僵硬模型关节软骨作用的组织学观察课题负责人：王贵盛课题类型：自选本项目系列课题切片地点：新医大一附院包研所实验费用：由自己课题经费支出。（3）哈药马脂对大鼠关节僵硬模型胫后神经变化的组织学观察课题负责人：康 辉课题类型：自选本项目系列课题切片地点：新医大一附院包研所实验费用：由自己课题经费支出。
