1、细胞破碎常用方法方法 技术 原理 效果 成本研磨法 细胞被研磨物磨碎适中 便宜组织捣碎法 细胞被捣碎机捣碎适中 适中匀浆法 须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎剧烈 适中机械法超声波法 用超声波的空穴作用使细胞破碎适中 昂贵酶法 外加酶或自溶法细胞壁被消化，使细胞破碎温和 昂贵有机溶剂法 有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳适中 便宜化学法表面活性剂法 表面活性剂溶解细胞壁温和 适中渗透冲击 渗透压破坏细胞温和 便宜反复冻融法 15至-20冷冻，再室温下融化，膜的疏水键被破碎温和撞击破碎干燥法 体细胞失水 剧烈物理法温度差破碎法思考题 1 常用的细胞破碎的方法有哪些？2 有机溶剂法破碎细胞原理，
2、常用的有机溶剂有哪些3 酶法破碎细胞原理4 反复冻融法破碎细胞原理层析技术方法简介层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等） ，使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动根据交换剂的属性、层析的分离的原理可将层析分类如下相，从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。分类（1）分配层析（2）离子交换层析（3）凝胶过滤层析（4）亲和层析（5）吸附层析一、离子交换层析基本流程上样：洗脱：pH 梯度洗脱；或离子强度梯度洗脱检测、记录分部收集。离子交换分离基本原理不同氨基酸（蛋白质、酶、蛋白激素等）等电点不同，在同 pH 条件下带
3、电性能不同，与交换剂结合力大小不同，结合较松的先被洗脱出来，结合较紧的后被洗脱出来，从而被分开。阳离子交换剂交换原理：RC-C1+C2+ RC-C2+C1+离子交换层析过程中的关键技术 1、交换剂处理 漂洗 目的是除去杂质用倾倒法除去细小颗粒（这一步一定要到做位。留下细小颗粒会堵塞层析柱下的尼龙网眼。 ）直至水清澈无色。 处理 用酸碱轮换浸泡，以便使交换剂带上需要的平衡离子。 平衡 经处理后，要用大量的水悬浮交换剂，最后用缓冲液平衡 2、柱的选择与装柱 装填均匀，松紧一致，没有气泡，没有裂缝。3、上样要求 加入样品液的体积一般应小于床体积的 1/3。4、洗脱剂原则四条：阴离子交换剂选用阳离子缓
4、冲液（如氨基乙酸、铵盐、Tris 等） ，阳离子交换剂选用阴离子缓冲液（如乙酸盐、磷酸盐等） ，以防缓冲离子参与交换过程，降低交换剂的交换容量。缓冲液 pH 值的选择要使被分离物质的电荷与平衡离子电荷的正负性相同。选用的缓冲系统对分离过程无干扰。要确定一定的离子强度。5、洗脱速度洗脱速率太快和太慢都会降低分辨率。二、凝胶过滤层析1、原理：在凝胶颗粒所构成的立体的网状结构中，蛋白质的分子颗粒越大，受到凝胶颗粒的排阻越大，下行越快，优先洗脱出来；分子颗粒越小受到的排阻越小，阻力越大，洗脱出来的速度越慢。2、 常用凝胶： (1)天然凝胶：琼脂糖凝胶 (2)人工合成凝胶:葡聚糖凝胶（其商品名称 Sep
5、hadex） ，有 G-25，G-75 ，G-100 ，G-200 等型号的凝胶。其中 G 后面的数据为得水值，即每 g 干胶吸水毫升再乘以 10. 不同规格的凝胶性质不同，常用 G-25 脱盐。3、 应用： (1)分离、纯化与鉴定； (2)测定相对分子质量；三 亲和层析1、原理：利用生物大分子间专一亲和力的层析技术。 2、应用： 酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅因子、抗原与抗体、激素与其受体。四 吸附层析1、原理：利用各种成分被表面具有吸附分子特性的固体的吸附程度及其在分离溶剂中的溶解度差异进行分离，取决于物质的分子结构。 2、分类： (1)物理吸附，如：活性炭； (2)化学吸附，如：氧化
6、铝； (3)交换吸附，如：硅胶。思考题：1.什么叫层析技术？常用的层析技术有哪些？2.指出常用层析技术的应用范围。3SephadexG-100 凝胶柱层析分离蛋白质原理是什么？ 4.用 Sephadex G25 脱盐时蛋白质和盐哪个先出峰？ 5.相对分子量为 8 万和 10 万的蛋白质能否在 SephadexG-75 柱中分开？为什么？6.将分子量分别为 a（90 000） 、b（45 000） 、c（110 000）的三种蛋白质混合溶液进行凝胶过滤层析，正常情况下，将它们按被洗脱下来的先后排序。 7.离子交换层析与凝胶过滤哪种分辨率高？ 8.离子交换层析的原理？9.如果样品中只有 Ala 和
7、 His(Ala pI=6.0,His pI=7.6)，在 pH4 条件下，这两种氨基酸那一种与CM（阳离子交换剂）结合的紧密？如果用 pH4-7 的洗脱液梯度洗脱，那种氨基酸先洗脱出来？（图片）10. 柱层析时湿装柱的注意事项有哪些？11.说说离子交换层析中洗脱液的选择原则 12.如何利用凝胶过滤层析测定蛋白质相对分子质量电泳原理与技术目前常用的电泳系统为区带电泳。任何电泳技术方法，均是以某种载体或支持介质作为样品中蛋白质的泳动跑道，常见凝胶电泳的支持介质有（1）聚丙烯酰胺凝胶（2）琼脂糖凝胶（3）淀粉凝胶。一 聚丙烯酰胺凝胶电泳（一）PAGE 技术流程简介1.组架（玻板、胶条、U 型玻板、
8、封胶）2.制胶（分离胶溶液、浓缩胶溶液、插入梳子）3.点样4.电泳5.染色6.脱色7.分析（二）丙烯酰胺凝胶聚合原理与凝胶结构1、聚合原理：聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是用丙稀酰胺和交联剂甲叉双丙烯在催化剂的作用下聚合而成。通常采用过硫酸铵或核黄素来引发该过程,以 N,N,N,N-四甲基乙二胺(Tetranmethylenediamine,TEMED)为增速剂。该引发-增速的催化系统实质是自由基催化的氧化-还原过程。聚合好的凝胶是立体网状结构。2、凝胶浓度和蛋白质分子量的关系凝胶中网眼的大小与胶的浓度有关，凝胶的浓度越小，其网眼越大，胶的浓度越大网眼越小。分离分析较小的蛋白质分子时用较高浓度的凝胶
9、，而分离分析分子量较大的蛋白质时则用较大浓度的凝胶。（三）影响凝胶聚合速度主要因素1、引发剂和增速剂的浓度：浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在 4060 分钟内完成。2、系统 pH 值 酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳 pH 值，以获得最佳的聚合结果。3、温度 低温下聚合导致凝胶变脆和混浊；适当提高温度可以是凝胶透明而有弹性；4、分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气。5、系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合；（四）PAGE 分离蛋白质原理PAG 系统电泳分离蛋白质具有很高的分辨率，因为该系统工作状态下存在三种效应。1 浓
10、缩效应 指样品在进入分离胶之前被浓缩成一条细线的现象。 （1）在电泳系统中有含甘氨酸的 Tris-HCl(pH8.5)电极缓冲液，浓缩胶 pH6.5，通电后样品中的各种带负电荷的蛋白质会在快离子(Cl -)和慢离子(0.1%Gly -)形成的高压带之间初步分开并形成很窄的条带，而使整个样品中的蛋白质在将进入分离胶时会形成一条细线，即被浓缩之效果。 （2）蛋白质样品从网眼较大的浓缩胶进入网眼较小的分离胶时遇到的阻力突然变大。2.电荷效应 在设置好的浓缩胶及分离胶特定 pH 条件下，不同蛋白质所带电荷多少不同，并在稳定的静电场中向异极泳动的动力所决定的泳动速度不同，最终会被分离。3.分子筛效应 分
11、离胶内属于立体的网状结构，分子量较大的蛋白质颗粒向异极泳动受到的阻力较大，泳动较慢，而分子量较小的蛋白质则阻力较小，向异极泳动较快，最终被分开。（五）影响蛋白质泳动速度及分离效果主要因素1.系统的 pH 值凝胶体系及电极缓冲液的 pH 决定样品中蛋白质的带电性质，直接影响蛋白质的电泳方向和泳动速度。pH 一般设置成大于样品中蛋白质的等电点，蛋白质均荷负电，电泳方向朝阳极。而当 pH 小于样品中蛋白质的等电点时，则所有蛋白质分子荷正电，静电场中向阴极泳动。前一种电泳系统属于碱性电泳，后者成为酸性电泳。2.电场强度普通电泳 520V/cm 电压降(电位梯度)。高压电泳 7000V/cm 电压降(电
12、位梯度)。3.温度电泳过程中由于电流作用致使凝胶发热，热效应对电泳有很大影响。温度升高时介质粘度下降，分子热运动加剧，自由扩散变快，有效迁移率增加，但对于蛋白质分离不利。另外较高温度会使凝胶变形，分子筛效应降低，影响分离。因此，一般要求在 15-25之间进行电泳效果较好。4.电渗作用电泳介质或支持物(如凝胶)在电极缓冲液中吸附带电离子，使溶液相对带电，进而在电场作用下，溶液就会向一定方向移动，这种想象称为电渗现象。带电溶液的移动会影响蛋白质的泳动。二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE:十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）（一）SDS-PAGE 分离基本原理SDS 是一种阴离子去污剂
13、，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入 SDS 和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与 SDS 结合后，形成带负电的蛋白质-SDS 胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS 聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。因此，SDS-PAGE 过程中蛋白质分子在凝胶中的泳动速度主要取决与亚基的分子量大小。与 PAGE 技术方法相似，蛋白质亚基
14、在电泳过程中存在三效应。（二）未知蛋白质分子量的测定以不同分子量的标准蛋白进行 SDS-PAGE 电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行 SDS-PAGE 电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量；思考题：1.常见的凝胶电泳有哪几种？说明其主要用途，并比较其主要优缺点。2.简单说明 PAGE 技术方法对于样品中蛋白质的分离效果较好的主要因素有哪些，并简单解释相应因素产生的有原因。3.从分离原理和实际应用两方面简单说明 SDS-PAGE 和 PAGE 技术方法有何主要区别？4.影响蛋白质电泳分辨率的主要因素有哪些？5.聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白
15、时，使用的电泳缓冲液 PH8.3，那么样品应点在哪端？为什么？样品应点在负极端，因为电泳缓冲液 PH8.3，在这样的环境中，血清蛋白的几种蛋白质电离后都带上负电荷，所以只有点样在负极端，外加电压后，才能向正极移动，彼此才能分开。蛋白质含量测定方法简介一、几种蛋白质定量测定方法比较原理 波长(nm) 特点 适用双缩脲法肽键与铜离子发生双缩脲反应 540简单、迅速灵敏度一般类脂、色素等干扰一般浓度30-500gmLFolin-酚法肽键与铜离子发生双缩脲反应+钨蓝和钼蓝650同上灵敏度高100 倍一般浓度5-100gmL考马斯亮蓝G250法染料结合法-青色复合物 595简单迅速，物质少，灵敏度高；去
16、污剂干扰0-1000g/mL 紫外吸收法共轭双键的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸280简单快速灵敏度高核酸干扰大致估计 二、思考题1 紫外吸收法与 Folin-酚比色法测定蛋白质含量相比，有何缺点及优点？2 若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？3 试说明考马斯亮蓝 G250 法的优缺点。参考答案：1、紫外吸收法 优点：简单快速，灵敏度高。缺点：核酸干扰2、校正:计算待测蛋白质溶液的 OD280/OD260 比值后，查(紫外分光光度法测定蛋白质含量校正数据表）校正因子“F ”值，根据经验公式 -蛋白质浓度 (mg/ml)=F1/dOD280D 计算该溶液的蛋白质浓度；D-溶液的稀释倍数，d 比色杯的厚
17、度（cm）3、考马斯亮蓝 G250 当该染料与蛋白质结合后为青色 ，在波长 595nm 有最大吸收；其吸收值与蛋白质含量成正比。灵敏度高（0-1000 g/mL ） ，是常用的微量蛋白质快速测定法。缺点：、大量的去污剂如 TritonX-100，SDS 等严重干扰测定。B、蛋白质与改染料 2min 反应达平衡，其结合 物在室温下 1h 内稳定。时间太长，结果偏低。 离心技术一、概念、用途、设备和基本操作1.概念：离心技术是利用离心机旋转时产生的强大离心力对大小、形状和密度不同的混合物进行分离的一种方法。 2.用途： 分离细胞器、大分子物质； 固、液相分离； 测定某些纯物质的性质。3.设备：离心
18、机4.基本操作：（1）将待分离的物质悬浮于一定的介质中，装入离心管；（2）精确平衡之后，对称放置于转头的插孔中；（3）当转头旋转时，各种物质粒子在离心力作用下因各自大小、形状和密度的差异而以不同速度沉降，一段时间后，即被分离。二、离心（centrifugation ）分离的基本原理1. 粒子的沉降速度（其中：t:沉降时间 :悬浮介质的黏度 rp:颗粒半径 p:颗粒密度 ：介质密度 rt:旋转中心到液面的距离 rb:旋转中心到管底的距离 - 角速度）由公式可知，在一定离心场中，颗粒的沉降速度不仅与离心力有关，而且与颗粒大小、密度以及介质黏度有关。一组不同的颗粒在同一条件下离心时则可以根据它们的密
19、度和颗粒大小而分离。 2. 相对离心力 (relative centrifugal foce RCF)（1）离心场产生的离心力的表示：习惯使用法：转速 转/分（r/min）缺点：如果旋转半径不同，则粒子所受的离心力不同标准法：相对离心力（RCF ）表示方法：数字g 如：10000g（2）相对离心力与转速的换算计算法 RCF = 1.11910-5（r/min) 2r（g）图表法 根据旋转半径（r） 、RCF 、r/min 的列线计算图进行换算三、离心机 (centrifuge) 1. 制备离心机2. 分析离心机 属于超速离心机，具有光学观测系统。 制备离心机适用范围最大转速（r/min）最大相
20、对离心力（g）特点 用途普通离心机 6 000 6 000型号很多，容量不同，转速不同，控制不精密 固液沉淀分离高速离心机 25000 90 000型号较多，转速不同，有控温装置，控制精密（时间、转速） 菌体、细胞碎片、细胞器等的分离超速离心机 80 000 500 000控制精密：时间控制、温度控制、转速控制、真空系统细胞器分级分离、病毒、DNA、RNA、蛋白质分离提纯等四、转头1 分类：水平转头、角式转头和垂直管转头2 注意事项各种转头的离心管腔的大小、形状均有许多规格，以适应各种转速、样品量、分离目的、分离方法。需要注意：（1）每个转头都有一定的使用限度（次数，运转时间） 。超过限度使用
21、，其最大额定速度应降低 10%。二次超限使用，再降 10%。每个转头必须单独建挡，记录使用次数和最大速度下的使用时间。（2）转头上标定的最大额定转速是有条件的。五、常用离心技术1. 沉淀离心 选定一定的时间、速度进行离心，使样品液中的大的固型物与液体分离，从而获得沉淀或上清夜。又称为固液分离法。使用普通离心机2. 差速分级离心 在均匀介质中，利用各种物质粒子沉降速度的不同而分批分离的方法。3.区带离心法原理：利用各种粒子的沉降速度和浮力密度差异，当一定粒子到达与其密度相同的梯度位置时则停止沉降，不同粒子处于不同位置，则得到了分离。分类：（1） 差速区带离心法：根据分离样品颗粒的不同沉降速度而分
22、层。（2） 等密度区带离心法：根据微粒的不同密度而分层。密度梯度材料：要求：无毒；合理的密度范围；易于颗粒分开。类型：糖类（蔗糖） 、无机盐（氯化铯） 、硅溶胶（Ludox） 、有机碘化物思考题：1.相对离心力为 30，000g，转头平均半径为 10cm,求转速 r/min （rpm ）? （两种方法） 2.制备离心机有哪几种类型？比较它们的特点和用途。3.在离心场中物质沉降的速度与哪些因子有关。4.差速区带离心法和等密度离心法的区别是什么？5.常用密度梯度的材料有哪些？6.几种离心技术的特点？沉淀技术一 、 概 述1、 定 义 ： 沉 淀 分 离 是 通 过 改 变 某 些 条 件 或 添
23、加 某 种 物 质 ， 使 某 溶 质 在 溶 液 中 的 溶 解 度 降 低 ，从 溶 液 中 沉 淀 析 出 ， 而 与 其 他 溶 质 分 离 的 技 术 过 程 。 沉 淀 分 离 是 生 化 物 质 的 分 离 纯 化 过 程 中 经 常 采用 的 方 法 。2 原 理 ：生 化 产 品 的 分 离 制 备 技 术 都 是 根 据 混 合 物 中 的 不 同 组 份 分 配 律 的 差 别 ， 把 它 们 分 配 于 两 个 或 几个 物 相 中 （ 如 有 机 溶 剂 抽 提 、 盐 析 、 结 晶 等 ） 。 或 者 将 混 合 物 置 于 某 一 相 （ 大 多 数 是 液 相
24、 ） 中 ， 外加 一 定 作 用 力 ， 使 多 组 份 分 配 在 不 同 区 域 ， 从 而 达 到 分 离 的 目 的 （ 如 电 泳 、 超 离 心 、 超 滤 等 ） 。除 了 一 些 小 分 子 ， 如 氨 基 酸 、 脂 肪 酸 、 某 些 维 生 素 及 胆 固 醇 类 外 ， 几 乎 所 有 生 物 大 分 子 都 不 能 融 化 ，也 不 能 蒸 发 ， 只 限 于 分 配 在 固 相 或 液 相 中 ， 并 在 两 项 中 相 互 交 替 进 行 分 离 纯 化 。二 、 常 用 的 沉 淀 法1 盐 析 沉 淀 法盐 析 沉 淀 法 简 称 盐 析 法 ， 是 利 用
25、 溶 质 在 不 同 的 盐 浓 度 条 件 下 溶 解 度 不 同 的 特 性 ， 通 过 在 溶液 中 添 加 一 定 浓 度 的 中 性 盐 ， 使 某 种 物 质 从 溶 液 中 沉 淀 析 出 ， 从 而 与 其 他 组 分 分 离 的 过 程 。 盐析 沉 淀 常 用 于 蛋 白 质 等 的 分 离 。原 理 ： 蛋 白 质 在 水 中 的 溶 解 度 受 到 溶 液 中 盐 浓 度 的 影 响 。 一 般 在 低 盐 浓 度 的 情 况 下 ， 蛋 白 质 的溶 解 度 随 盐 浓 度 的 升 高 而 增 加 ， 这 种 现 象 称 为 盐 溶 。 而 在 盐 浓 度 升 高 到
26、 一 定 浓 度 后 ， 蛋 白 质 的 溶 解度 又 随 盐 浓 度 的 升 高 而 降 低 ， 结 果 使 蛋 白 质 沉 淀 析 出 ， 这 种 现 象 称 为 盐 析 。 在 某 一 浓 度 的 盐 溶 液 中 ，不 同 蛋 白 质 的 溶 解 度 各 不 相 同 ， 由 此 可 达 到 彼 此 分 离 的 目 的 。2 等 电 点 沉 淀 法通 过 调 节 溶 液 的 pH 值 至 某 种 溶 质 的 等 电 点 (pI)时 ， 使 其 溶 解 度 降 低 ， 沉 淀 析 出 ， 而 与 其 他组 分 分 离 的 方 法 称 为 等 电 点 沉 淀 法 。由 于 在 等 电 点 时
27、两 性 电 解 质 分 子 表 面 的 水 化 膜 仍 然 存 在 ， 使 酶 等 大 分 子 物 质 仍 有 一 定 的 溶 解 性 ，导 致 沉 淀 不 完 全 。 所 以 在 实 际 使 用 时 ， 等 电 点 沉 淀 法 往 往 与 其 他 方 法 一 起 使 用 ， 例 如 ， 等 电 点 沉 淀法 经 常 与 盐 析 沉 淀 、 有 机 溶 剂 沉 淀 和 复 合 沉 淀 等 一 起 使 用 。 有 时 也 单 独 使 用 等 电 点 沉 淀 法 ， 主 要 是用 于 从 粗 酶 液 中 除 去 某 些 等 电 点 相 距 较 大 的 杂 蛋 白 。在 加 酸 或 加 碱 调 节
28、pH 值 的 过 程 中 ， 要 一 边 搅 拌 一 边 慢 慢 加 进 酸 或 碱 ， 以 防 止 局 部 过 酸 或 过 碱而 引 起 酶 变 性 失 活 。3 有 机 溶 剂 沉 淀 法利 用 要 分 离 物 质 与 其 他 杂 质 在 有 机 溶 剂 中 的 溶 解 度 不 同 ， 通 过 添 加 一 定 量 的 某 种 有 机 溶 剂 ， 使某 种 溶 质 沉 淀 析 出 ， 从 而 与 其 他 组 分 分 离 的 方 法 称 为 有 机 溶 剂 沉 淀 法 。原 理 ： 有 机 溶 剂 之 所 以 能 使 某 些 溶 质 沉 淀 析 出 ， 主 要 是 由 于 有 机 溶 剂 的
29、存 在 会 使 溶 液 的 介 电 常数 降 低 。 例 如 ， 20 时 水 的 介 电 常 数 为 80， 而 82 乙 醇 水 溶 液 的 介 电 常 数 为 40。 溶 液 的 介 电 常数 降 低 ， 就 使 溶 质 分 子 间 的 静 电 引 力 增 大 ， 互 相 吸 引 而 易 于 凝 集 。 同 时 ， 对 于 具 有 水 膜 的 分 子 来 说 ，有 机 溶 剂 与 水 互 相 作 用 ， 使 溶 质 分 子 表 面 的 水 膜 破 坏 ， 也 使 其 溶 解 度 降 低 而 沉 淀 析 出 。常 用 的 有 机 溶 剂 有 乙 醇 、 丙 酮 、 异 丙 醇 、 甲 醇
30、等 。 例 如 ， 蛋 白 质 通 常 采 用 乙 醇 或 丙 酮 进 行 沉 淀 ，DNA 和 RNA 可 用 乙 醇 或 2-乙 氧 基 乙 醇 进 行 沉 淀 等 。注 意 事 项 ： （ 1） 有 机 溶 剂 沉 淀 法 容 易 引 起 蛋 白 质 、 酶 等 物 质 的 变 性 失 活 ， 所 以 必 须 在 低 温 条件 下 操 作 ， 而 且 沉 淀 析 出 后 要 尽 快 分 离 ， 尽 量 减 少 有 机 溶 剂 的 影 响 。 （ 2） 有 机 溶 剂 沉 淀 法 的 分 离效 果 受 到 溶 液 pH 值 的 影 响 ， 一 般 应 将 溶 液 的 pH 值 调 节 到
31、要 分 离 物 质 的 等 电 点 附 近 。 （ 3） 有 机溶 剂 在 中 性 盐 存 在 的 条 件 下 可 以 减 少 蛋 白 质 的 变 性 ， 提 高 分 离 效 果 ， 所 以 在 利 用 有 机 溶 剂 进 行 蛋 白质 的 沉 淀 分 离 时 ， 要 添 加 0.05mol L 左 右 的 中 性 盐 。 但 是 中 性 盐 的 存 在 会 增 加 蛋 白 质 在 有 机 溶 剂中 的 溶 解 度 ， 故 中 性 盐 不 宜 多 加 。4 核 酸 的 沉 淀 分 离选 择 适 宜 的 溶 剂 进 行 处 理 ， 使 蛋 白 质 等 杂 质 变 性 沉 淀 而 获 得 核 酸
32、， 这 种 方 法 又 称 为 选 择 性 溶 剂沉 淀 法 。 例 如 ， 在 核 酸 的 提 取 液 中 加 入 氯 仿 -戊 醇 或 氯 仿 -辛 醇 ， 振 荡 一 段 时 间 ， 使 蛋 白 质 在 氯仿 -水 的 界 面 上 形 成 沉 淀 而 除 去 ， 核 酸 仍 然 留 在 水 溶 液 中 ； 在 对 氨 基 水 杨 酸 等 阴 离 子 化 合 物 存在 的 条 件 下 ， 用 苯 酚 -水 溶 液 提 取 核 酸 ， DNA 和 RNA 在 水 溶 液 中 ， 而 蛋 白 质 在 苯 酚 层 中 形 成 沉 淀 而被 除 去 ； 在 DNA 和 RNA 的 混 合 液 中
33、， 用 异 丙 醇 选 择 性 地 沉 淀 DNA， 而 RNA 留 在 溶 液 中 。由 于 选 择 性 变 性 沉 淀 法 是 使 杂 质 变 性 沉 淀 ， 又 对 目 的 物 没 有 明 显 影 响 ， 所 以 在 应 用 本 法 之 前 ，必 须 对 要 分 离 物 质 以 及 溶 液 中 的 杂 蛋 白 等 杂 质 的 种 类 、 含 量 及 其 物 理 化 学 性 质 等 有 比 较 全 面 的 了 解 。思考题：1 蛋白质沉淀的常用方法有哪些2 什么是盐析，盐析的原理，列举盐析时常用的盐3 简 述 等 电 点 沉 淀 及 原 理4 什 么 是 有 机 溶 剂 沉 淀 ， 列 举
34、 常 用 的 有 机 溶 剂酶 的 提 取 纯 化 与 活 力 测 定酶 是 蛋 白 质 ， 凡 能 用 于 分 离 纯 化 蛋 白 质 的 方 法 都 适 用 于 酶 ， 各 种 预 防 性 的 措 施 也 同 样 适 用 于 酶 。 在 酶 的 提 取 分 离 过 程 中 ， 应 注 意 工 艺 的 特 殊 要 求 。 如 在 总 的 纯 化 要 求 上 ， 蛋 白 质 分 离 始 终 在 温 和 条 件 下 进 行 ，而 酶 的 分 离 在 不 破 坏 酶 活 力 的 限 度 内 ， 可 以 采 用 “猛 烈 ”手 段 ， 尽 可 能 除 杂 。 如 ： 有 蔗 糖 存 在 时 ， 蔗
35、糖 转 化 酶能 经 受 更 高 的 温 度 。另 外 ， 酶 的 催 化 活 性 是 选 择 其 提 纯 方 法 和 操 作 条 件 的 指 标 ， 整 个 过 程 都 需 测 定 总 活 力 和 比 活 力 ； 收 得 率 和 纯度 。一 .酶 的 分 离 与 提 取(一 ） 了 解 所 分 离 酶 在 细 胞 中 分 布 细 胞 产 生 的 酶 有 二 类 ：1.细 胞 外 酶由 细 胞 内 产 生 后 分 泌 到 胞 外 发 挥 作 用 的 酶 。 这 类 酶 大 部 分 属 于 水 解 酶 ， 通 常 含 量 高 ， 容 易 得 到 。2.细 胞 内 酶在 细 胞 内 合 成 后 并
36、 不 分 泌 到 细 胞 外 ， 而 在 细 胞 内 起 催 化 作 用 。 该 类 酶 在 细 胞 内 往 往 与 细 胞 器 结合 ， 不 仅 有 一 定 的 区 域 性 ， 而 且 催 化 的 反 应 具 有 一 定 顺 序 性 。（ 二 ） 材 料 的 获 取 在 提 取 某 一 酶 时 ， 首 先 应 当 根 据 需 要 ， 选 择 含 此 酶 最 丰 富 的 材 料 。 由 于 从 动 物 内 脏 或 植 物 果 实中 提 取 酶 制 剂 受 到 原 料 限 制 ， 成 本 又 很 大 ， 因 此 ， 目 前 工 业 上 大 多 采 用 培 养 微 生 物 的 方 法 来 获 得
37、大量 的 酶 制 剂 。（ 三 ） 酶 分 离 纯 化 的 主 要 步 骤 （ 抽 提 、 浓 缩 、 纯 化 、 结 晶 ）1.抽 提破 碎 细 胞 ， 动 植 物 组 织 一 般 可 用 组 织 捣 碎 器 ； 或 者 加 石 英 砂 研 磨 ， 将 材 料 做 成 丙 酮 粉 或 进 行 冰冻 融 解 ； 对 细 菌 ， 常 采 用 加 砂 或 加 氧 化 铝 研 磨 和 超 声 波 振 荡 方 法 破 碎 。大 多 数 酶 一 般 都 用 缓 冲 液 进 行 抽 提 ， 缓 冲 液 的 类 型 决 定 于 酶 的 种 类 和 理 化 特 性 ， 抽 提 液 pH最 好 远 离 等 电
38、点 。 2 浓 缩抽 提 液 或 发 酵 液 中 酶 浓 度 往 往 很 低 ， 必 须 浓 缩 富 集 。 常 用 的 浓 缩 方 法 有 ： 加 中 性 盐 或 冷 乙 醇 沉淀 后 再 溶 解 ， 胶 过 滤 浓 缩 以 及 超 过 滤 浓 缩 法 等 。3 纯 化（ 1） 原 则 ： 一 方 面 是 要 提 高 酶 的 纯 度 ， 另 一 方 面 却 也 使 酶 的 总 量 不 可 避 免 有 所 损 失 。（ 2） 分 离 纯 化 方 法a.盐 析 法 （ 如 硫 酸 胺 ） b.有 机 溶 剂 沉 淀 法 c.层 析 纯 化 法 （ 葡 聚 糖 凝 胶 、 阴 离 子 交 换 层
39、析 ） d.等 电 点 法 e.吸 附 分 离 法 4. 结 晶 浓 缩 液 经 过 各 种 方 法 的 纯 化 ， 可 得 到 较 纯 的 结 晶 产 品 。 二 .酶 活 力 及 其 测 定 （ 一 ） 酶 活 力 定 义 是 酶 促 反 应 的 能 力 。 酶 活 力 大 小 就 是 指 在 一 定 条 件 所 催 化 的 某 一 化 学 反 应速 度 的 快 慢 ， 即 酶 催 化 的 反 应 速 度 越 快 ， 酶 活 力 越 高 ， 反 之 则 表 示 该 酶 活 力 低 。 （ 二 ） 如 何 测 定 酶 活 力 ？ 初 速 度 的 测 定 是 关 键（ 三 ） 常 用 的 酶
40、活 力 单 位 在 标 准 条 件 (25 、 最 适 pH、 最 适 底 物 浓 度 )下 ， 每 分 钟 能 催 化 1 mmol 底 物 转 化 成 产 物所 需 要 的 酶 量 定 义 为 1 个 国 际 单 位 (IU)。 在 最 适 条 件 下 ， 每 秒 钟 能 催 化 1 mol 底 物 转 化 成 产 物 所 需 要 的 酶 量 为 1 个 Kat 。 自 定 义 的 活 力 单 位蛋 白 酶 活 力 单 位 习 惯 定 义 ： 1 个 1min 内 将 底 物 酪 蛋 白 分 解 产 生 1g 酪 氨 酸 的 酶 量 。淀 粉 酶 活 力 单 位 习 惯 定 义 ： 1 小
41、 时 内 水 解 1g 淀 粉 的 酶 量 。 有 的 部 门 则 采 取 每 小 时 分 解 1ml2%的淀 粉 溶 液 的 酶 量 为 1 个 活 力 单 位 。（ 四 ） 酶 的 比 活 力比 活 力 =酶 活 力 单 位 数 /酶 蛋 白 质 量（ 五 ） 酶 的 纯 度纯 化 倍 数 =纯 化 后 的 比 活 力 / 粗 抽 提 液 比 活 力产 率 (回 收 率 ) =纯 化 后 的 总 活 力 单 位 / 粗 抽 提 液 总 活 力 单 位纯化步骤 总蛋白（g）总活力比活力(u/mg蛋白)纯化倍数 收得率（%）1粗抽提液 30 21000 0.7 1 1002氯化锰处理 7.64
42、 15017 2.0 2.8 723冰冻融解 5.58 14872 2.7 3.8 714DEAE- 纤维素层析 0.113 5025 44.5 63.5 245硫酸铵盐析 0.048 3467 71.7 102.0 176羟基磷灰石柱层析 0.016 3133 200.0 286.0 157聚丙烯酰胺凝胶电泳0.012 3100 255.0 365.0 15思 考 题1. 某酶在一定条件下，5 min 内使 30 mmol 底物转变为产物，问该酶的活力（IU）是多少？2. 从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液 300mL 含有 150mg 蛋白质，总活力为 360 单位。经过一系列纯化以后得到的 4mL 酶制品(含有 0.08mg 蛋白)，总活力为 288 单位。请问回收率是多少？纯化了多少倍？3.简述酶分离纯化的基本过程4 酶的制备及提取过程中应注意哪些事项5 常用的酶活力单位？6 比活力概念及意义
