1、DNA的粗提取与鉴定,选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。,提取DNA的方法,一、提取生物大分子的基本思路,问题思考与讨论：,根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下， DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？,DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。,二、DNA的溶解性,0.14mol/L,曲线解读：1、在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解 度随NaCl溶液浓度的
2、增加而逐渐降低；2、在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；3、当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又 逐渐增大。,当氯化钠的物质的量浓度为 2 molL时，DNA的溶解度最大，浓度为 014 molL时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出,如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？,DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离,2、DNA在酒精溶液中的溶解性,3、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响,大多数蛋白质不能忍受6080C的高
3、温，而DNA在80C以上才会变性,洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响,（二）、DNA的鉴定原理, DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂,甲基绿 （绿色）,利用该特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离的目的。,DNA不溶于酒精，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步地分离。,粗提取,提纯,与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的
4、特性摸索提取的条件，设计特定的方法。,三、DNA的粗提取与鉴定的实验设计,（一）实验材料的选取,1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取23种实验材料）,2、原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大,动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、动物细胞,讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜.,2、植物细胞,讨论：加
5、入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？,答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解,实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液,答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等.,讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,（三）去除滤液中的杂质,讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？,答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在
6、低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质.,讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离.,2、 DNA的鉴定,鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml 试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色,以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取,
7、案例一：,本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因：一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。,为什么用鸡血细胞做实验材料？,能否选用牛、羊、马血做实验材料？为什么？ 不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核，仅靠白细胞和淋巴细胞中的少数DNA，在实验中很难提取到。,1、制备鸡血细胞液,2、破碎细胞，释放DNA,3、溶解细胞核内的DNA,4、DNA的析出提取,5、DNA的初步纯化提纯,6、DNA的鉴定,提取DNA的具体步骤,1、制备鸡血细胞液,取质量浓度为0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液1
8、00 mL，置于500 mL烧杯中，注入新鲜的鸡血（约180 mL），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免血液凝结。将烧杯中的血液置于冰箱内，静置1d，使血细胞自行沉淀。用吸管除去上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。,讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？,答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，除去的上清液是血浆.,2、破碎细胞，释放DNA,向鸡血细胞液中加入蒸馏水，并且搅拌，从而使血细胞膜和核膜胀破。用玻璃棒搅拌可以加速细胞的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA。,释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用
9、34层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质。,此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？,可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。,讨论：,答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至涨破,（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？,（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？,答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA,（3）滤去的是什么物质？得到的是什么？,答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA,3、溶解细胞核内的DNA,在浓度较高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚，游离出的DNA溶解在溶液中
10、。在溶液中加入两倍体积的浓度为2 mol/L的NaCl溶液，搅拌1 min。注意应沿一个方向搅拌，使DNA充分溶解。,4、DNA的析出提取,将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。,加蒸馏水降低NaCl溶液浓度，使DNA析出。,实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量，使NaCl溶液的始终浓度为0.10.2 mol/L。加水太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。,讨论：加入蒸馏水的目的？,降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出.,为什么反复地溶解与析出DNA，能够去
11、除杂质？,1、用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质； 2、用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。 因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。,滤取含DNA的粘稠物,用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中，含 DNA的粘稠物被留在纱布上,将DNA的粘稠物再溶解,取 1个 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 molL的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中.,过滤含有DNA的氯化钠溶液,取1个100 mL烧杯，用放有两
12、层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中.,提取含杂质较少的DNA,在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为 95的溶液 50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA,答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中,讨论：,（2）观察丝状物呈什么颜色？,答：白色,（1）为什么要加50mL的冷酒精？,取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0015 molL的溶液5 mL
13、，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化, DNA的鉴定,讨论：,答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色,（2）这一鉴定结果说明什么问题？,（1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？,答：提取出的丝状物是DNA,答：整个实验共“两次蒸馏水，四次过滤，两次析出”,6、讨论：,两次蒸馏水,第一次：细胞吸水胀破 第二次：使 DNA黏稠物析出,（1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出？分别在哪一步？,四次过滤,第一次：
14、DNA存在于滤液里第二次： DNA存在于滤液里第三次： DNA被留在纱布上 第四次： DNA存在于滤液里,两次析出,第一次：用0.14 molL 的NaCI溶液含杂质多,第二次：用冷却的95的酒精,如果使用植物材料，必须研磨充分。,5、DNA的初步纯化提纯,如果提取的DNA量不够多且其中含有较多杂质，或者加入溶液和搅拌等操作过程不规范，都会导致实验现象不明显，常常使制取的DNA粗制品不能显示出DNA的本色白色。,为了增进实验效果，需要对DNA粗制品进行简单的提纯。,6、DNA的鉴定,二苯胺法：,紫外灯照射法：,用蒸馏水配制质量分数为0.05%的溴化乙锭(EB)溶液，将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹
15、到蜡纸上，再滴1滴EB溶液染色。将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室中)，可呈现橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在260 nm处)。,电泳法：,适合鉴定纯度较高的DNA。,DNA与二苯胺沸水浴呈现蓝色。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。,提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步
16、是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。,提取DNA的实验操作主要步骤的目的,过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液 目的:获得含核物质的滤液 过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液 目的:获取纱布上的粘稠物 过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液 目的:得到含DNA的滤液,本实验中有三次过滤 ,分别有什么作用?,第一次搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液 加速细胞的破裂第二次搅拌加2mol/LNaCl溶液的滤液 使DNA与溶液混合均匀第三次搅拌加蒸馏水至0.14mol/LNaCl溶液 稀释NaCl溶液,析出DNA第四次搅拌放入2mol/LNaCl溶液中纱布上的粘稠物 使DNA尽可能多的溶于溶液中第五次搅拌体积分数为95%的酒精 提取含杂质较少的DNA,实验中有五次用玻璃棒搅拌?分别有什么作用?,（四） DNA的析出与鉴定,DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95 ） ，静置23min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。,1、DNA的析出,
