1、1细 胞 工 程 实 验采克俊 编湖州师范学院生命科学学院2前 言细胞工程是一门生命科学理论和工程技术相结合的综合性学科，是生物技术和生物工程的重要组成部分。通过实验课程的学习，使学生系统掌握该门学科的实验原理、实验技术和操作要领，培养创新能力。小鼠是最常用的实验动物，绝大多数的细胞工程实验教程都以小鼠为取材对象。然而，在中小城市的普通高校，一般没有建立专门的实验动物中心，每次使用都要从外地购买；自己饲养不但耗费精力，小鼠的臭味也影响周围环境。鸡也是一种极好的实验动物，在各地都普遍饲养，材料来源极为便利。本书全部以鸡作为实验动物，共分十章，从实验准备、基本操作技术，到细胞观察检测、冷冻保存、典
2、型细胞培养与转基因技术等进行了全面论述，并结合自己的实践体会，特别针对实验的技术关键和操作注意事项等进行了讨论。本实验课程准备工作为：提前 10 天购买种蛋并分批孵化，提前一周制备酸缸，提前 2 天安排学生清洗消毒。请同学们对讲义编写和实验课提出宝贵建议。采克俊2007 年 12 月3目 录实验一、细胞培养实验器材和试剂的准备 4实验二、鸡胚胎成纤维细胞的原代培养11实验三、培养细胞的形态观察及活率检测16实验四、鸡胚胎成纤维细胞的传代培养测20附录：274实验一 细胞培养实验器材和试剂的准备一、实验目的能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和过滤除菌法的操
3、作，了解化学消毒法的使用方法和常用试剂的配制。二、实验原理清洗与消毒是细胞培养实验的第一步，也是最基本的步骤，工作量最大。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0.1g/L，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。取材进行原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液，传代
4、培养时也需要将贴壁细胞从瓶壁上消化下来，常用的消化液有胰酶（Trypsin ）溶液和EDTA溶液，有时也用胶原酶（collagenase）溶液。胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常见有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。组织培养用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25% 浓度，配制时要用不含Ca 2+、Mg 2+及血清的平衡盐溶液，因为这些物质会对胰酶产生抑制作用。EDTA溶液也常用来解离细胞，它的作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞，还可以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。EDTA 溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶，配制后可过滤除菌，也可
5、高温消毒灭菌。细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基，即指所有用于各种目的的体外培养、保存细胞用的物质，就其本意上讲为人工模拟体内生长的营养环境，使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力。它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。细胞培养基其组成成分主要有：水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他一些入核酸降解物、激素等。大多数培养液中使用酚红作为pH指示剂。红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫色表示碱性pH。三、实验材料、用品51 材料：无臭氧型紫外灯、微孔滤膜(直径25 cm) ：孔径为 0.22m、微孔滤膜( 直径90 cm)：孔径为0.22 m 、过滤
6、器 (直径25 cm)。2 药品：70或75酒精、0.1新洁尔灭、煤酚皂溶液(来苏儿水)、0.5过氧乙酸，乳酸、37甲醛、高锰酸钾、NaOH、盐酸、重铬酸钾、浓硫酸(工业)、纯水。3 仪器和器材：眼科剪刀和镊子、长镊子、培养皿、培养瓶、试剂瓶（或盐水瓶） 、酒精、酒精灯、棉球、试管架、吸耳球、卷纸，移液枪、枪头、一次性手套、10毫升试管、10毫升离心管、巴氏吸管、5毫升（或10毫升）吸量管、不锈钢过滤器、塑料过滤器、注射器、超净工作台、干燥箱、高压灭菌锅、正压泵。图1-1 纯水制备系统（左）和高压灭菌锅（右）6图1-2 包装用铝饭盒（左） 、塑料过滤器（中）和干燥箱（右）四、实验步骤1 指导教
7、师带领参观实验室，介绍常用仪器的操作方法及注意事项。图 1-3 单人单面超净工作台（左）和双人单面超净工作台（右）7图 1-4 CO2 供气钢瓶的减压阀及压力表2 清洗1）新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡 5%稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。2）使用过的玻璃器皿的清洗(1)使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。(2)用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥或烘干。(3)浸酸性洗液过夜。操作者要戴两层乳胶手套，将玻璃器皿沉人酸液中。吸管要捆扎、瓶皿装入尼龙网袋内。酸液的配制：先在耐高温塑料桶中用热水搅拌溶解重铬酸钾，冷却后缓慢加入浓硫酸，用玻棒不停搅拌，防止
8、温度上升过快和出现重铬酸钾结晶。新配制的酸液为棕红色，遇有机溶剂和水分增多时变成绿色，表明失效。表1 酸液的配制组成 重铬酸钾(克) 浓硫酸（mL） 蒸馏水（mL）8强度弱液 100 100 1000次强液 120 200 1000强液 63 1000 200(4)从酸性洗液捞出后自来水冲洗 10-15 次去除残余酸液，蒸馏水涮洗 3 次，倒置烘干。 (5)包装(牛皮纸或一般纸)，小件物品可置于饭盒内，贴好标签。 (6)高压(15 磅 20 min)或干热 (170 2 h)灭菌，取出后检查包装是否完好，标签在否。(7)烘干后，贮存备用。 3）胶塞的处理 (1)新胶塞应先用清水清洗之后再用 0
9、.2NaOH 煮沸 10-20 min。 (2)自来水清洗 10 次。 (3)再用 1稀盐酸浸泡 30 min。 (4)自来水清洗 10 次，蒸馏水涮洗 3 次。晾干，高压灭菌。旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。3 消毒1）物理消毒法 (1)紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。进行室内消毒时，紫外线9灯应距地面 25 米，使各处有 006 微瓦能量的照射。紫外线消毒时产生臭氧，对身体有害。细胞培养操作之前，先打开超净工作台和房间的紫外灯照射至少 30
10、分钟后在关闭，然后再通风 30 分钟才可入室工作。目前有的实验室采用电子灭菌灯代替紫外灯进行空气消毒。(2)干热灭菌 主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至 160，保温 90-120 min。用于 RNA 提取实验的用品则需 180，保温 5-8 h。 (3)湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些耐高温的塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如 Hanks 液、PBS-等)。自动高压灭菌锅操作如下： 首先查看高压锅内的水是否充足（到锅底水平线处），放入物品盖好盖。按 start
11、钮打开电源（参数已经设好，不必改动），开始高压，在温度达 80时显示器开始显示温度，当温度达到所需的设定温度时，在显示屏的左下角有一长形的指示灯闪亮，直到高压时间结束后指示灯灭，此时蜂鸣器报警一声。当压力降至0 MPa 时，蜂鸣器再报警一声。温度降至 80时，蜂鸣器报警 10 次。显示屏温度指示消失，此时才可打开锅盖。 关电源，开高压锅盖，取出已灭菌的物品，烘干。 (4) 过滤除菌 用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器(直径 90 mm、100 mm
12、、142 mm等)，配以过滤泵使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器(直径 20 mm、25 mm 等) 。滤膜孔径有 0.60 m、0.45 m 、 0.35 m、0.22 m、0.10m 等，以 0.22 m 除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。微孔滤膜的孔径小而均匀，对微粒的截留能力强；空隙率大，阻力小，滤速快；无介质脱落；不影响药液的 pH 值；吸附性小；滤膜用后弃去，不会产生交叉污染。10主要缺点是易堵塞、易破碎。药液需经粗滤和精滤后才可用微孔滤膜滤过，使用前需做完整性检查，即用无菌空注射器吸一段空气然后加压，能够反弹即为完整。正压式除菌滤器为金
13、属结构，中间垫一种特制的混合纤维素酯微孔滤膜，其过滤速度较快，效果较好，被多数实验室采用。滤过除菌时，常使用 0.22 微米孔径的滤膜。滤器上下层各有一槽，放置硅胶垫圈，将滤膜压紧固定。滤膜使用时应注意：滤膜薄且光滑，容易移动，安装时膜位置一定要放正。过分干燥的滤膜很脆，在高压或高温干燥时易破裂，因此安装前可先用三蒸水润湿滤膜。为保证过滤效果，在使用时，每次垫两张滤膜，上面一张孔径为 0.45 微米，下面一张孔径为 0.22 微米，或两张均为 0.22 微米。使用无齿玻片镊子夹取滤膜，以防止镊齿弄破滤膜。加大压力时用力应均匀，用后打开滤器对光检查滤膜是否移动和有无破裂。用双层布或纸包好，（小型
14、号的可置于饭盒内），贴好标签，湿热灭菌后 37烘干或自然晾干，不能高温烘干。滤膜用后丢弃。若过滤少量液体，可将小型针头滤器安装在注射器上使用。目前许多厂家有一次性针头滤器出售。国产针头滤器易污染。（5）煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸 15 min 后使用。2）化学消毒法 常用的消毒液有如下几种：(1) 70(或 75)酒精：超净台里常备 70酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。(2) 0.1新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常备盛有 0 .1%新洁尔灭溶液的容器及纱布。 11(3) 来苏儿水 (煤酚皂溶液) ：主要用于无菌室
15、桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷撒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。 (4) 0.5%过氧乙酸：是强效消毒剂，10 min 即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用喷撒和擦拭方式进行。 (5) 乳酸蒸气：将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭 1-3 d。可将空气中漂浮的微生物杀死。 (6) 37%甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将 37甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气。1-3 d 后方可达到消毒空气的目的。 (7)甲醛消毒方法：a) 计算房间体积，按 10g/m3 的比例
16、秤出甲醛。 b) 将甲醛倒甲醛发生器或加热盘或烧杯中，并放好加湿用水，必要时还可加入高锰酸钾（2-3g/m 3 ）,然后加热（甲醛发生器用蒸汽加热，加热盘或烧杯可用热水盛入其中加热）使其蒸发成气体。 c) 灭菌流程：空调器停止运转启动甲醛气体发生器或在加热盘中热甲醛让甲醛气体扩散约 30 分钟启动空调器让甲醛气体循环约 30 分钟 停止空调器，房间熏蒸消毒，时间不少于 8 小时房间排气，用新鲜空气置换约 2 小时恢复正常运行。当相对湿度在 65%以上，温度在 2440时，甲醛气体的消毒效果最好。 4 试剂的配制1）PBS 8.0g NaCl、0.2gKCl、2.2gNa 2HPO4、0.12g
17、KH 2PO4 溶于 1000 mL 双蒸水，高压灭菌，4保存。 （准备盐水瓶或试剂瓶）2）干粉培养基过滤除菌（先准备好不锈钢过滤器及滤膜，安装后高压灭菌，适度烘干；铝盒4个，三角瓶2个，容量瓶，不锈钢过滤器一套，酒精灯，酒精棉球3瓶，吸耳球3个，吸量管10毫升和5毫升各5根，分装用瓶，血清，超纯水，抗生素）认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO 3、谷氨12酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO 3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。配制方法（1L）：1）在一个尽可能接近总体积的容器中加入大约500mL双蒸水。 2）在室温（20到30）的
18、水中加入干粉培养基。 3）水洗袋内残留培养基，全部转移到容器内，轻轻搅拌，不要加热。 4）完全溶解之后，1袋1L粉状DMEM加3.7g NaHCO 3，1mmoLL丙酮酸钠，即0.11g/L，添加双抗。 5）用双蒸水定容到1L，搅拌溶解。注意不要过分搅拌。 6）通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH 值（此步常可省略）培养基在过滤前要保持密封。 7）立刻不锈钢过滤器过滤除菌，贴上标签，4保存备用。3）胰蛋白酶-EDTA 消化液胰蛋白酶溶液配制：称取胰蛋白酶（1:250）粉末 0.25g 置烧杯中，溶于 100mL PBS，搅拌混匀，置室温 4 小时并不断搅拌振荡，过滤除菌。 （
19、若配制 400 mL 则应称取 1g 胰蛋白酶）EDTA 溶液配制：0.2g EDTA 用 400mL PBS 溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶， 4冰箱保存。胰蛋白酶与 EDTA 按 1：1 混合后分装，4 冰箱保存。4）抗生素液双抗（青霉素、链霉素）各 1 克，溶于 100mL 纯水，过滤除菌，分装，4冰箱保存。使用前 1：100 稀释。五、注意事项1、清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗 10-15 次。因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。枪头和试管一定要用超声清洗处理后逐个清洗。如没有洗净会影
20、响下一次使用的效果。 2、干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过100时，不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至 100之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。133、高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。4、牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压。需要长期保存的血清必须储存于-20-80 低温冰箱中。 4冰箱中保存时间切勿超过 1 个月。由于血清结冰时体积会增加约 10 %，因此，血清在冻入低温冰箱前，不要装得太满，必须预留一定体积空间，否则易发生污染或玻璃瓶冻裂（其他溶液冻存也是如此）。一般厂商提供的
21、血清为无菌，无需再过滤除菌。如发现血清有悬浮物，则可将血清加入培养液内一起过滤，切勿直接过滤血清。血清解冻需采用逐步解冻法，切勿直接将血清从-20进入 37解冻，这样因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沉淀的发生。待全部溶解后再分装。5、滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜(有时可在上面加一层定性滤纸)，包好，经高压灭菌后才能使用。过滤前可用压进空气的办法测试过滤器是否完好，压进空气时感觉到有较大的阻力，去除压力后针筒会反弹即为完好无损。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过。压力太大时微孔滤
22、膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。装滤膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。 6、使用化学消毒法时，配制 75%酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。 7、培养基过滤器过滤除菌注意事项：(1) 细胞培养用水一般为三蒸水（经石英蒸馏器蒸馏）或超纯水，医药生产上一般为注射用水。(2) 建议尽量选择与所用量相匹配的包装一次使用，因为包装
23、一旦打开，组分可能会变质或因受潮而结团。(3) 溶解干粉培养基时先加入终体积 90%95% 的培养用水，添加剂加完后再定容。(4) 如需添加的组分较多时，某一组分完全溶解后，再添加另一组分。14(5) 待培养基完全溶解后再加入碳酸氢钠，以免产生沉淀。(6) 所有成分完全溶解后，培养基应立即过滤或高压除菌，以免产生沉淀或有微生物污染。(7) 由于除菌过滤后， pH 值可能会升高 0.1-0.2 个单位，因此在过滤前，可将 pH调至比所需值低 0.1-0.2 个单位。(8) 在细胞培养过程中，建议不加或加少量的抗生素，如血清的浓度较低则所加抗生素的量也要相应降低一些。(9) 建议用 1N HCl
24、或 1N NaOH 来调节培养基的 pH，因为用碳酸氢钠调 pH 值对培养液的渗透压影响比较大。8、物品放进饭盒后要贴好标签，还需要用棉布或牛皮纸包好再贴上标签。在标签处包扎好。容器，包括装 PBS 的玻璃瓶，瓶口要拧松，不能紧，瓶口包扎牛皮纸，灭菌后立刻拧紧瓶盖，然后再取出，冷却后放入冰箱。注意检测标签是否脱落。9、根据每个实验的要求，准备好所需物品，一并放入超净台内。实验器材准备的数量要大于实际使用数，瓶盖要大于瓶数。要配备至少三套器械（一套使用，一套备用，一套清洗灭菌），循环使用。10、玻璃瓶、移液管要封闭包扎使用端，标记手持端。六、思考题1、哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。2、细胞
25、培养常用液体如何配制和灭菌？3、简单介绍动物细胞培养实验室常用仪器的操作方法及注意事项。实验二 鸡胚胎成纤维细胞的原代培养一、实验目的15掌握动物细胞的分离、原代培养和换液方法，能独立地进行细胞原代培养操作。二、实验原理细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养(Primary culture)。原代培养细胞离体时间短
26、，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。鸡胚胎成纤维细胞（Chick embryonic fibroblasts, CEF）是从9-11天鸡胚中分离的疏松结缔组织的主要细胞，属生长与裂殖迅速的细胞族群，在适当的体外培养条件下，能迅速增长繁殖，并在生长过程中分泌多种生长因子，所以常用来制作饲养层。这些细胞为成纤维状，故称为成纤维细胞。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、
27、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。原代培养时，游离期一般为 3-4h，5-6h 后绝大部分细胞贴壁，12h 之后即可进入增殖期，细胞增殖较快，当达到一定的密度(60-70 %汇合) 时，生长更为迅速。眼观形成致密的单层细胞，倒置显微镜下观察,细胞透明，贴壁细胞生长良好，呈梭状，有多个突起伸出，含 1-2 个细胞核，细胞界限清晰。长满时细胞之间无间隙，也没有细胞重叠现象，重新贴壁的成纤维细胞颜色较深，细胞质中有许多黑色小颗粒，死亡的 CEF 漂浮在培养液中，整个细胞呈黑色、边缘粗糙。三、实验材料、用品1、器材解剖剪、解剖镊、眼科剪(尖头、弯头)、眼科镊(尖头、弯头
28、)、培养皿、试管、吸管、橡皮头、离心管、培养瓶、枪头、不锈钢过滤器等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，灭菌、烤干备用、枪头盒。超净台内放置废液盘或烧杯，提前 3016分钟开紫外灯。此外，还有倒置显微镜、超净工作台、培养箱、CO 2 供气钢瓶、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、酒精喷壶、打火机、试管架、记号笔、移液器等。2、试剂无钙、镁磷酸盐缓冲液(PBS)、细胞消化液：胰蛋白酶-EDTA、DMEM 液、完全培养基（含血清） 、双抗。3、材料9-10 日龄的鸡胚。四、实验步骤实验进行前，准备好相关器材，无菌室及超净工作台以紫外灯照射灭菌 30-60分钟（溶液同时 37预热），然后开启通风 10
29、 分钟后，才开始实验操作。实验用品以 75% 酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在中央无菌区域酒精灯火焰旁进行。1、取 9-10 日龄的鸡胚，用酒精消毒，在超净工作台内，小心取出鸡胚，放在无菌培养皿中，除去头尾、四肢及内脏；2、胚体用含双抗 PBS 冲洗 2-3 次，切成 1-2mm3 的小块（尽量剪碎即可），然后转入容积适量大小的三角瓶内（或培养皿、离心管、烧杯）；3、按每个鸡胚加入大约 5mL 的胰酶消化液，在室温（或 37）下消化 10 min，吸管（或枪头）不停吹打；4、加入含小牛血清培养液终止消化，收集细胞悬液，没有消化完全的组织块可再消化一次；5、收集到的细胞悬液经 100
30、目过滤筛（或纱布）过滤，1200 转离心 5 min；离心管用酒精擦拭后拿进超净台，拧开盖子后，管口过火焰两次，倒出上清，保存管口向下蘸一下干的酒精棉球，再保存管口向下过火焰两次；176、细胞沉淀用含 10%小牛血清的 DMEM 培养液重新悬浮；7、以 5105 个 /mL 的密度接种到培养瓶中（大约 20-30mL 细胞液/鸡胚），观察细胞形态（绘图），将瓶盖微松，于 37、5% CO 2 浓度、饱和湿度条件下培养。（指导教师故意打开瓶盖，设一污染对照供观察，学生制备的剩余细胞供下次染色实验用。）8、3-4 小时后观察，有部分细胞已经贴壁，由圆形变为梭形（略）。9、细胞培养 24 小时后，旋
31、紧瓶口，取出观察，观察的重点如下：（1）培养物是否被污染，主要观察培养液颜色的变化及混浊度。如培养液变为黄色且混浊，表示已经被污染。（2）细胞生长状况与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。可能是瓶塞未盖紧或营养液 pH 过高。（3）培养液若变为桔红色，一般显示细胞生长良好。10、 经过 1 天的培养后，即可形成单层（图 2-3），应及时换液（实验三）。继续培养，直到细胞贴满瓶底后（约共 2 天）进行传代培养（实验四）。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以 75% 酒精擦拭无菌操作抬面。 18图 2-1 原代培养的鸡胚胎成纤维细胞，大约 70%汇合五、注意事项1、严格无菌操作
32、。 洗手、着装与外科临床要求相同；手指不能触及器材的使用端；一切操作要在酒精灯火焰前方进行，瓶口、吸管使用前要经过火焰消毒；吸管火焰消毒后冷却再使用，细胞悬液混匀、接种时离火焰要远一些，防止烫伤细胞；酒精灯火焰要用打火机点火，不要用火柴，一旦发生着火事故，立即关闭超净台风机，用饭盒、湿布扑灭火焰；吸管吸过培养基、血清等后不要经过火焰消毒，因为吸管中残留的液体会被烧结碳化，损伤细胞；吸管要专管专用，并要勤换；瓶口滴液不能倒流回到瓶内，可用干酒精棉球擦拭，瓶口再经过火焰消毒；2、所有溶液最好 37预热，外壁经酒精棉球擦拭后送入超净台内。 六、思考题1、如何进行鸡胚胎成纤维细胞的原代培养。2、原代培
33、养时如何从组织分离细胞?3、绘图展示自己的实验结果、谈谈你的实验感想。19实验三：培养细胞的形态观察及活率检测一、实验目的学习观察不同类型的细胞体外培养的形态特征及生长状况，掌握细胞活率检测和计数方法。二、实验原理体外培养的细胞主要有两种状态。一种是能贴附在培养支持物上的细胞，叫贴壁型细胞，体外培养的细胞绝大多数都属于这种细胞。另一种细胞并不贴附在容器的壁上，而是悬浮在培养液中生长，叫做悬浮型细胞，这类细胞主要是血液原性或癌原性的细胞。贴壁细胞一般有两种形状，即上皮细胞形和成纤维细胞形细胞。上皮细胞形细胞呈扁平的不规则多角形，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片，如 HeLa 细胞
34、。成纤维细胞形细胞形态与体内成纤维细胞形态相似，胞体呈梭形或不规则三角形，中央有圆核，胞质向外伸出 2-3 个长短不同的突起，细胞群常借原生质突连接成网，如 NIH3T3。由于培养基内有 pH 指示剂的存在，因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色时，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色时，则可能是培养时问过长，营养不足，死亡细胞过多；如呈紫红色，则可能是细胞生长状态不好，或已死亡。实际上，一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的，它随营养、pH 、生长周期而改变，但在比较稳定的条件下形态基本是一致的。在贴壁细胞培养中，镜下折光率高，圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞。贴壁细胞在生长状态良
35、好时，细胞内颗粒少，看不到有空泡，细胞边缘清楚，培养基内看不到悬浮的细胞和碎片，培养液清澈透明，而当细胞内颗粒较多，透明差，空泡多时，表明生长较差。当瓶内培养基混浊时，应想到细菌真菌污染的可能。在细胞生物学的实验中，往往要进行活细胞的鉴定和细胞的计数、调整细胞的密度，是进行实验必不可少的一种基本技能。活细胞的细胞膜完整，染料台盼兰(trypan blue)或伊红 Y (eosin Y)不能进入，不被染色，而死细胞细胞膜破裂，染料进入，染上颜色, 这被称为染料排除检测法（图 3-1） 。20图 3-1 台盼兰染料排除检测法的原理三、实验用品1、器材无菌吸管、橡皮头、枪头。此外，还有显微镜、血细胞
36、计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、试管架、记号笔等。超净台内放置废液盘或烧杯，提前 30 分钟开紫外灯。2、试剂无钙、镁磷酸盐缓冲液(PBS)、DMEM 液、完全培养基、台盘蓝染液、伊红染液等。3、材料传代培养鸡胚胎成纤维细胞四、实验方法(一)培养细胞的形态观察1、将细胞培养瓶从二氧化碳培养箱中取出，注意观察细胞培养液的颜色和清澈度。然后，将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上，此时应注意不要将瓶翻转，也不要让瓶内的液体接触瓶塞或流出瓶口。212、打开倒置镜光源，通过双筒目镜将视野调到合适的亮度。3、调节载物台的高度进行对焦，在看到细胞层之后，再用细调节器将物像调清楚，注意观察细胞的轮
37、廓、形状和内部结构。在观察时，最经常使用的是 20X 物镜（绘图） 。(二) 观察细胞体外培养状况细胞培养 24h 后，即可进行观察，观察的重点如下：A首先要观察培养细胞是否污染（观察阳性对照样品， （绘图） ） 。主要观察培养液颜色的变化及混浊度。B观察培养基颜色变化及细胞是否生长。C如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。观察时可参照(2)的描述进行。D观察完毕，可用台盼蓝染液对细胞进行染色。以确定死、活细胞的比例。(2)细胞的生长阶段及其形态特征传代培养的细胞需逐日进行观察，注意细胞有无污染，培养液颜色的变化及细胞生长的情况。般单层培养的细胞，从培养开始，经过生长、繁
38、殖、衰老及死亡的全过程。它是一个连续的生长过程，但为了观察及描述，人为地将具分为 5 个时期，但各期间无明显绝对界限。现分别描述如下：A游离期：当细胞经消化分散成单个细胞后，由于细胞原生质的收缩相表面张力以及细胞膜的弹性。所以，此时细胞多为圆形，折光率高，此期可延续数 h。B吸附期 (贴壁)：由于细胞的附壁持性，细胞悬液静置培养一段时间(约 7-8h)后，便附着在瓶壁上(此期不同细胞所需时间不同)。在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞，如圆形、扁形、短菱形。细胞的特点，大多立体感强，细胞内颗粒少，透明。C繁殖期：培养 l2h 以后直到 72h，细胞进入繁殖期，加速了细胞生长和分裂。此期包
39、括由几个细胞形成的细胞岛(即由少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群，常散在地分布在瓶壁上)，到细胞铺满整个瓶壁(即所谓形成细胞单层)的过程。此期22细胞形态为多角形(呈现上皮样细胞的特征)。细胞特点：透明，颗粒较少，细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。根据细胞所占瓶壁有效面积的百分率，又可将其生长状况分为四级。以“ 十 ”的多少表示如下：十：细胞占瓶壁有效面积(也就是细胞能生长的瓶壁面积)的 25以内有新生细胞。一般要观察 3-5 个视野内的细胞生长状况，然后加以综合分析判断。十十：细胞占瓶壁有效面积的 25-75以内具新生细胞。十十十：细胞占瓶壁有效面积的 75-95具新生细胞。细胞排列致密。
40、但仍有空隙。十十十十：细胞占瓶壁 95以上，细胞已长满或接近长满单层，细胞致密，透明度好。从十十一十十十十为细胞的对数增长期(或称为指数增长期)。D维持期：当细胞形成良好单层后，细胞的生长与分裂都减缓，并逐渐停止生长，这种现象被称为细胞生长的接触抑制。此时细胞界限逐渐模糊，细胞内颗粒逐渐增多，且透明度降低，立体感较差。由于代谢产物的不断积累，维持液逐渐变酸。此时营养液已变为橙黄色或黄色。E衰退期：由于溶液中营养的减少和日龄的增长，以及代谢产物的累积等因素，此时细胞间可出现空隙，细胞中颗粒进一步增多，透明度更低，立体感很差。若将细胞经固定染色处理后，可见细胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，细胞皱
41、缩，逐渐死亡，从瓶壁上脱落（三）换液选择生长良好的细胞，旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭后放入超净台内；轻轻摇晃培养瓶，在酒精灯旁打开瓶塞，在酒精灯上烧口消毒，吸出（或者倒出，酒精棉球擦拭瓶口）原培养基，再加入等体积预热的含血清新鲜培养基。（四）台盼兰染色1） 配制 0.2(W/V)台盼兰水溶液（溶于 PBS，加热使之完全溶解，用滤纸或纱布23过滤除渣，装入瓶内室温保存） ，及 4.25 %(W/V) Nacl 溶液；2） 测定前，取 4 份 0.2台盼兰与 1 份盐水混合；3） 取台盼兰溶液，另入到等量细胞悬中(细胞浓度 2-5106 细胞/ mL)混匀；4） 将细胞悬液加入血球计数板中，使液体自然
42、充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加。分别计数末染色的细胞数(活细胞)及染色的(死细胞)细胞数。细胞计数 200 个以上， （绘图） 。5）计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）100 %。放大的计数室按下式进行细胞浓度的计数：注 4 大格中的每一大格体积为 0.1mm3。1mL=l，0000 大格，因此，1 大格细胞数10 4=细胞数mL。注 染色标本在 15 分钟内检查计数，因为台盼兰染液可以迅速地使死细胞24染上蓝色，延长时间活细胞也将着色，用此方法来分辨死活细胞。进行细胞计数时应力求准确，因此，在科学研究中，往往将计数板的两侧都滴加上细胞悬液，并同时滴加几
43、块计数板(或反复滴加一块计数板几次)，最后取结果的平均值。（五）伊红 Y 染色1） 配制 0.2(W/V，溶于 PBS)伊红 Y 水溶液；2） 取 0.1mL 细胞液悬(细胞浓度 2-5106 细胞/ mL)，加入等量伊红 Y 溶液混匀；3）2 min 后将细胞悬液加入血球计数板中，镜检、计数。死细胞染成桃红色，活细胞不着色， （绘图） 。细胞计数 200 个以上。4）计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）100。五、注意事项细胞计数要注意把计数器和盖片擦干净，用酒精擦或水洗后晾干。细胞计数的原则（压线者数上不数下，数左不数右）六、思 考 题1、简述培养细胞的形态观察方法及注意事项。2
44、、简述台盼兰染色和伊红染色检测细胞活率的原理及操作方法。3、绘图展示自己的实验结果、谈谈你的实验感想。25实验四：鸡胚胎成纤维细胞的传代培养一、实验目的了解传代细胞的传代方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长状况二、实验原理传代培养是组织培养常规保种方法之一，也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养是指细胞从一个培养瓶以 1：2 或以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养（图 4-1） 。这种培养，第一步也是制备细胞悬液，当细胞长成致密单层时，它很容易被蛋白水解酶和 EDTA 所破坏。所以般采用胰蛋白
45、酶和EDTA 的混合物，做为消化液。当 CEF 长满时就可进行传代，传代能较快的繁殖CEF。用胰酶消化原代细胞时，细胞伪足收缩，细胞呈球型。传代 0.5-1h 左右，细胞开始贴壁生长，可见一个或多个细胞伪足伸出，约 2-3h 后即出现细胞增殖，倍增时间约 24-28h（图 4-2） 。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。图 4-1 动物细胞原代培养与传代培养及细胞系和细胞株的比较26实验前首先在倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。如发现细胞有污染迹象，应
46、立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的 PBS 或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。注意要将培养用液要提前置 37下预热。三、实验用品1、器材吸管、橡皮头、培养瓶、枪头、离心管等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，灭菌、烤干备用。超净台内放置废液盘或烧杯，提前 30 分钟开紫外灯。此外，还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、记号笔等。2、试剂无钙、镁磷酸盐缓冲液(PBS)、细胞消化液：胰蛋白酶-EDTA、DMEM 液、完全培养基（血清）等3、材料原代培养鸡胚胎成纤维细胞。四、实验方法在做传代细
47、胞培养之前，首先将培养瓶置于显微镜下，观察原代培养的细胞是否铺满培养瓶底部（绘图） ，如已长成单层，即可进行细胞的传代培养。1、完全培养基配制:DMEM 液 90小牛血清 10双抗(1 万单位mL) 加至约 100 单位mL272、取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内；3、从培养箱内取出细胞，取出细胞时要旋紧瓶盖，再在镜下观察细胞。用酒精棉球擦拭后放入超净台内；4、在酒精灯旁打开瓶塞，在酒精灯上烧口消毒，吸出（或者倒出，酒精棉球擦拭瓶口）原培养液，然后用 PBS 清洗细胞 2 次，尽量除去残余的血清；5、25 mL 培养瓶中加入 0.2 mL（8 滴）的消化液进行消化，
48、以盖满细胞为宜，置于室温或放置于培养箱内，停留 1-2min 后，不停摇晃培养瓶。消化程度可在倒置显微镜下观察（绘图） ，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形，细胞之间不再连接成片为度；6、吸出消化液，加入适量的含小牛血清的培养液，反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞；7、收集细胞悬液，1200-1500 转离心 5 min（离心管要平衡） ，去上清（若无EDTA，此步骤可省略） ；8、用培养液重新悬浮细胞并计算细胞活率和密度，以 5105 个/mL 密度（1：3）接种到培养瓶中，在瓶侧壁做好标记；8、在倒置显微镜下观察培养瓶内的细胞形态和细胞浓度（绘
49、图） ；适当旋松瓶盖（不能太松） ，于 37、5% CO 2 浓度、饱和湿度条件下培养；9、4 小时后及第二天观察细胞生长情况（绘图） 。28图 4-2 贴壁培养细胞的消化与传代培养操作流程五、注意事项1、严格无菌操作，作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开，不同液体不要共用吸管。 2、所有溶液最好 37预热。 3、掌握好消化程度。4、正确摆放使用的用具，保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。六、思 考 题1、简述细胞传代培养的操作程序及注意事项。2、细胞传代培养获得成功的关键要素是什么?3、绘图展示自己的实验结果、谈谈你的实验感想。
