1、课题2 土壤中分解尿素的细菌的 分离与计数,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,1、实例：,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,原因：因为热泉温度70800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。,DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。,.筛选菌株,3、土壤中分解尿素的
2、细菌的分离与计数所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,1、显微镜直接计数：,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,.统计菌落数目：,不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,2.间接计数法（活菌计数法） 原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
3、，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,注意事项 为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。 为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,.设置对照：,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下 只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因：土样不同，培养基污染或操作失误(或者是混入了其他
4、的含氮物质),小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,二.实验的具体操作 .土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 .制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,应在火焰旁称取土壤10g。 在稀释土
5、壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,三样品的稀释,分离不同的微生物采用不同的稀释度,原因：不同微生物在土壤中含量不同,.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。,三.结果分析与评价 1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以
6、选择出分解尿素的微生物。 2.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。,四、操作提示,无菌操作,做好标记,规划时间,五.课外延伸在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现紫色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。,呈紫黑色，金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征,分解尿素细菌 酚红,本课题知识
7、小结:,练一练 用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比（ ） A.比实际值高 B.比实际值低 C.和实际值一致 D.比实际值可能高也可能低,B,下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是( )A. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水B. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、琼脂、水C. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、琼脂、水D. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水,A,请根据所学知识回答以下问题 （1）有2位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下2种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了3个平板统计的菌落数分别为21、212、256，并且取平均值163作为统计结果；请评价这两位同学的实验结果的有效性 甲同学_，原因是_。 乙同学_，原因是_。,
