1、肽(peptide),一、肽与肽键的结构,肽键：一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键(肽键)。所形成的化合物称为肽。,肽键是蛋白质分子中氨基酸的基本连接方式. 实验证据： 1)蛋白质分子中游离的-氨基和-羧基很少； 2)蛋白酶水解；逆转合成； 3)双缩脲（H2N-CO-NH-CO-NH2）与硫酸铜-氢氧化钠的颜色反应（紫红/蓝紫）； 4)人工合成的多聚氨基酸的X射线衍射图和红外吸收光谱与天然的纤维状蛋白质十分相似； 5)结晶牛胰岛素的成功合成完全证明了蛋白质肽链结构学说的正确性。,肽的命名与写法,Ser Val Tyr Asp - Gln 丝氨酰缬氨酰酪氨酰天冬氨酰亮氨酸
2、Leu - Ala - Tyr - Gly -Ser,氨基酸顺序：多肽链中氨基酸残基的排列顺序,四肽的主链结构,共价主链：NCC,Glu-Gly-Ala-Lys,由于C=O双键中的电子云与N原子上的未共用电子对发生“电子共振”，使肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转。,0.125nm 键长=0.133nm0.145nm,肽键共振的结果：限制自由旋转；形成酰胺平面(肽基平面、肽平面)；C-N键长度；永久偶极,由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称为肽键平面或肽单元。,由于-碳原子与其他原子之间均形成单键，因此两相邻的肽键平面可以作相对旋转,肽键反式构型
3、(P165),二、肽的物理和化学性质,1、短肽熔点高、偶极离子存在； 2、酸碱性质取决于：游离末端和R基上的可解离功能团。 3、小肽的滴定曲线：在给定的pH下，据Henderson-Hasselbalch (P132)方程可确定每个侧链占优势的电离态。,四肽甘氨酰谷氨酰赖氨酰丙氨酸的酸碱性质分析,4、颜色反应,1）N末端的aa与茚三酮发生定量反应。 2）双缩脲反应,凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。 优点是较快速、不同的蛋白质产生颜色的
4、深浅相近、干扰物质少；主要的缺点是灵敏度差。,L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu短杆菌肽S(环十肽),三、天然存在的活性肽,活性肽:分子量比较小、游离状态存在、具有特殊的生理功能的多肽。,？,蛋白质一级结构 的测定,蛋白质的一级(共价)结构(Primary structure),蛋白质的一级结构包括：组成蛋白质的多肽链数目、氨基酸顺序、多肽链内或链间二硫键的数目和位置。,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。,The Nobel Prize in Chemistry 1958,“for his work
5、 on the structure of proteins, especially that of insulin“,F.Sanger及其他工作者花了约10年时间于1953年首先测定出牛胰岛素的氨基酸顺序。,Frederick Sanger b. 1918 University of Cambridge United Kingdom,以后F.Sanger又测定了DNA核苷酸顺序，因而他第二次（1980年62岁）获得了诺贝尔奖（同美国人伯格、吉尔伯特共享）。,“for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, wi
6、th particular regard to recombinant-DNA“,The Nobel Prize in Chemistry 1980,“for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids“,Paul Berg,Walter Gilbert,Frederick Sanger,先天性疾病：一级结构差错引起如：血红蛋白亚基6 位Glu被Val代替（基因突变），即表现为镰刀状贫血，为世上最常见的血红蛋白病。若亚基6位Glu被Lys取代引起另一类贫血：血红蛋白病。细
7、胞色素C与物种进化的关系,蛋白质一级结构测定的意义,测定蛋白质的一级结构的要求,原 则 将大化小，逐段分析，制成两套肽片段，找出重叠位点，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的完整序列。,目前往往采用从待测蛋白质的基因序列反推出蛋白质的一级结构。,阶段一:测序前的准备工作(一)确定蛋白质分子中多肽链的数目通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。(二)拆分蛋白质分子的多肽链（由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分），分离纯化不同的多肽链,蛋白质测序的策略,对于借助非共价键连接在一起的寡聚蛋白质，如血红蛋白（四聚体）、烯醇化酶（二聚体），可用8 mol/L尿
8、素或6 mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).,(三)断开多肽链内的二硫桥,几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,(四)分析各多肽链的氨基酸组成(完全水解),并计算出氨基酸成分的分子比,先完全水解再测序。 1、酸水解(HCl)，辅以碱水解 2、氨基酸分析仪进行测定 水解中氨基酸遭破坏的程度与保温时间有线性关系。 蛋白质氨基酸组成：n mol aa/ mol pron g aa/100 g pro,阶段二:多肽链的测序(一)确定多肽链的N-末端和
9、C-末端残基,多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,1) 二硝基氟苯（DNFB）法 Sanger法,缺点：所有的肽键都被水解,碱性,黄色，能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,原理同DNFB法，但比它的灵敏度高100倍（DNS-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol），并且水解后的DNS-aa不需要提取，可直接用纸电泳或薄层层析进行鉴定。,2)DNS-Cl法 DNS(丹磺酰氯，二甲氨基萘磺酰氯),3) PITC 法 Edman试剂法,经抽提、干
10、燥，鉴定。,苯氨基硫甲酰多肽(蛋白质)，简称PTC多肽(蛋白质),加热,苯乙内酰硫脲衍生物PTH-aa,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,4)氨肽酶法,N末端氨基被封闭：如焦谷氨酰环化、乙酰化及环状肽等。焦谷氨酸氨肽酶。,5) 肼解法,C-端氨基酸分析法,无水条件下加热,肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从
11、多肽链的C-端逐个的水解。 测定不同反应时间释放出的氨基酸种类和数量，从而推知蛋白质的C-末端残基顺序。 常用的羧肽酶有四种：A（来自胰脏），水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基B（来自胰脏），只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键C（来自柑桔叶），Y（来自面包酵母）。,6) 羧肽酶法,(二)裂解多肽链成较小的片段,1）酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶,可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来,最常用，专一性强，只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键。,胰蛋白酶,肽链,断裂Phe Trp
12、 Tyr等疏水aa残基的羧基端,糜蛋白酶,肽链,水解位点,胃蛋白酶 Pepsin,R2R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。,水解位点,专一性较差,嗜热菌蛋白酶 thermolysin,R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu，异亮氨酸Ileu,蛋氨酸Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。,2） 化学法 (得到的肽段较大，适合自动序列仪),溴化氰裂解法(P175)只断裂甲硫氨酸残基的羧基参加形成的肽键,NH2OH在pH 9下能专一性地断裂Asn-Gly之间的肽键。但专一性不很强，Asn-Leu及Asn-A
13、la键也能部分裂解。 由于各种蛋白质中Asn-Gly键出现的概率很低，因此用这个方法得到的肽段都很大，这对相对分子质量大的蛋白质的序列测定是十分有用的。,对1)和2)中得到的肽段进行分离纯化：凝胶过滤、凝胶电泳、HPLC,羟胺断裂法,(三)确定每一肽段的氨基酸顺序,1、测序-Edman化学降解法(PITC法),Edman法一次能连续测出60-70个aa残基；改进形式：DNS-Edman测序法。蛋白质序列仪：灵敏度高，5 pmol,2、酶降解法氨肽酶和羧肽酶分别从N-、C-末端逐个向内切。 原则上实际只能用于测定末端附近很少几个残基。,3、质谱法要求：样品为挥发性。电喷射电离串联质谱法 (ESI
14、 tandem MS或MS/MS),（四）采用另一种特异性试剂将多肽链打断,重复前三步.,4、根据核苷酸序列的推定法（对分子量大或含量低的蛋白质很有效）待测蛋白免疫动物得到Ab 沉淀合成该蛋白的多核糖体(含该蛋白及其mRNA) 分离mRNA cDNA,第一套肽段： OUS PS EOVE RLA HOWT,第一套肽段： SEO WTOU VERL APS HO,末端残基：H S末端肽段：HOWT APS或OUS 第一套肽段： HOWT OUS EOVE RLA PS 第一套肽段： HO WTOU SEO VERL APS 推断全序列：HO WTOU SEO VERL APS,阶段三:氨基酸顺序
15、的拼接 1)利用重叠拼接法重建完整多肽链的一级结构,第一向 pH6.5,+,-,第二向,+,-,2)确定多肽链内和链间二硫键的位置.,一般用胃蛋白酶处理未断开二硫键的多肽链，再用双向电泳分离各肽段，过甲酸处理，将每个肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。,蛋白质测序举例,P180图,Protein Information Resource PIR(美国国家生物医学基金会)Gene Sequence Data BankGen Bank(美国政府)European Molecular Biology Laboratory Data BankEMBL(欧洲分子生
16、物学实验室数据库),蛋白质序列数据库,蛋白质的氨基酸序列与生物功能,一、同源蛋白质的物种差异与生物进化,1、同源蛋白质： 不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质，还包括具有明显序列同源的蛋白质。不变残基、可变残基,Charles Darwin (1809-1882),蛋白质分子中，由于种属来源不同，可改变的氨基酸，对蛋白质的生物功能是不重要的。而不可变氨基酸对功能是重要的。它们或是直接处于“活性中心”或对维持蛋白质特定构象起着重要作用。 在蛋白质中，一部分氨基酸对蛋白质执行生物功能起作用，而另一部分对蛋白质执行其生物功能不起作用。当对蛋白质执行功能起作用的氨基酸发生变动时，就会导致蛋白质生物功
17、能的丧失。,胰岛素都有降低血糖的功能，分析不同哺乳动物中的胰岛素，发现它们都是由51个氨基酸组成。其中有24个氨基酸始终保持不变，6个半胱氨酸残基的位置始终不变，这说明不同来源的胰岛素中A、B链之间都有共同的连接方式.三对-S-S-对维持高级结构起着重要作用，其它一些不变的氨基酸绝大多数都是非极性氨基酸。这些非极性氨基酸对维持胰岛素分子的高级结构起着稳定作用。 从而可知：不同来源的胰岛素，其空间结构大致相同，可变的氨基酸部分不影响胰岛素的活性。,2、细胞色素C,含血红素的电子转运蛋白。 由一百零几个aa组成。 28个不变残基，17位、14位、7080位的成串存在。 可变残基可能为一些填充、间隔
18、区域。 来自任何两个物种的同源蛋白质，其序列间的氨基酸差异数目与这些物种间的系统发生差异是成比例的。 进化位置上相差越远，其氨基酸序列间的差别越大。,生物进化的分子生物学证据,3、系统(发生)树、进化树(P183图),系统树是用计算机分析细胞色素C序列并找出连接分支的最小突变残基数的方法构建起来的。,Willi Hennig (1913-1976) 系统发生学（分支学）创始人,1、氧合血红素蛋白质(生物功能高度保守)Mb(153aa); Hb(链：141aa) (链：146aa)原始珠蛋白基因 2、丝氨酸蛋白酶类(生物功能趋异)胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶和纤溶酶祖先丝氨酸蛋白酶基因
19、 3、一些功能差异很大的蛋白质(来源、功能迥异)卵清溶菌酶(129aa)和人乳-乳清蛋白(123aa)。三维相似，共同祖先的证据丢失,二、同源蛋白质具有共同的进化起源,三、血液凝固与氨基酸序列的局部断裂,这一特性是在生物进化过程中发展起来的，是蛋白质结构与功能具有高度统一性的表现。,1、血液凝固过程中的级联过程- 12因子 2、凝血系统- 凝血酶原和血纤蛋白原 3、纤溶系统 - 纤溶酶原,The end,N 末端：多肽链中有自由氨基的一端 C 末端：多肽链中有自由羧基的一端,多肽链有方向性：,N端,C端,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,（二） 几种生物活性肽,1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH),GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,GSH 有抗氧化剂的作用，可还原细胞内产生的过氧化氢,谷胱甘肽的生理功用：解毒作用： 参与氧化还原反应： 保护巯基酶的活性： 抗氧化剂作用，维持红细胞膜的稳定：,体内许多激素属寡肽或多肽,神经肽(neuropeptide),2. 多肽类激素及神经肽,牛胰岛素的化学结构,
