1、安医一附院神经外科研究生 单明,肿瘤干细胞及胶质瘤干细胞的研究进展,Introduction,脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，常造成神经系统的功能障碍，对躯体和认知可引起复杂的损害，轻者给患者带来痛苦或者残疾，重者威胁生命。临床上目前针对胶质瘤患者，一般采取手术及放化疗方法治疗，但由于至今未找到脑肿瘤发病的关键环节，治疗效果不如人意，治愈率很低，5年生存率更低。这期间对于胶质瘤的认识：,Content,但这种解释无法合理肿瘤细胞的一些生物学特性：1.肿瘤细胞似乎具有无限生命力2.并非所有肿瘤细胞都能无限制生长的现象在一些研究中，通过比较肿瘤细胞和各种细胞的生物学特性，发现干细胞，作为
2、体内一种无限增殖和多项分化的细胞，其基本特性与肿瘤细胞的生长，浸润，复发情况很相似鉴于肿瘤细胞的以上特点，一些学者提出肿瘤干细胞的理论。即：,肿瘤干细胞学说,肿瘤干细胞学说： 肿瘤组织中存在着细胞群体可大致分为2类，即： 干细胞样癌细胞亚群，这种细胞在肿瘤细胞群体中含量少，却很重要，具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能，即“种子细胞”，在启动肿瘤的形成和生长中起着决定性的作用。2. 其余，统称为非肿瘤干细胞，其在肿瘤组织中，数量占绝大多数，但都属于”路过性细胞”，经过短暂的生长分化后，最终走向死亡。,肿瘤干细胞学说意义,这一理论的提出使我们重新认识肿瘤的起源和本质，改变了以往对肿瘤细胞的看法，
3、重新认识了肿瘤的“本元”在于含量较少的肿瘤干细胞，这为临床肿瘤的诊疗提供了新的方向和视觉角度。其中的脑胶质瘤起源于脑胶质瘤干细胞的学说对正确认识和理解脑胶质瘤的发生发展和生物学行为，如侵袭性、转移 、肿瘤的耐药性等均具有十分重要的理论意义和潜在的应用价值。对于脑胶质瘤的病因学研究，早期诊断及治疗方式的改进均具有重要的基础学意义及临床意义。,Doubt,肿瘤干细胞真的存在么？,肿瘤干细胞学说的诞生的现实依据,肿瘤干细胞学说的诞生是源于这样的现实：发现并非所有的肿瘤细胞均能维持肿瘤生长，仅有一小部分细胞具有产生集落的能力当时解释：1.所有肿瘤细胞均能无限增殖和形成集落，但这种可能性极小2.大部分肿
4、瘤细胞仅具有无限增殖能力，其中一小部分细胞具有无限增殖和形成肿瘤的能力。于是推测：肿瘤干细胞具有正常干细胞一样的自我更新和增殖分化能力，其来源可能是具有长期存活能力，通过基因突变和后生性变化积累逐渐向恶性化进展的正常干细胞，即正常干细胞恶性化形成的。,肿瘤干细胞存在的依据,已经证实： 干细胞生存时间远比分化细胞生存时间长，所以他们暴露于各种损伤因子的时间也相对较长，基因错误的累积则导致调节的障碍，从而导致恶性肿瘤的发生干细胞已经具有自我更新，多向分化的生物学特性，只要在经突变获得过度增殖能力，就具备了肿瘤细胞的特征，而分化细胞首先还需要一个去分化的过程，在接受相关基因突变才能成为肿瘤，显然，干
5、细胞更易形成肿瘤。,肿瘤干细胞寻在的依据,肿瘤组织具有异质性，即由表型和功能不同的细胞组成，这种异质性是由于在肿瘤形成过程中经历了不同的环境或积累了不同的突变所导致的。恶性程度跟肿瘤的异质性有关，合理猜测：这最有可能是肿瘤干细胞对突变的积累所导致的。 应用干细胞领域的研究技术，学者们陆续从白血病，乳腺癌，骨髓癌及脑肿瘤中分离获得了一类细胞，其仅占肿瘤细胞的一小部分，具有无限增殖，自我更新，多向分化等类似于正常干细胞的属性。证实了多种肿瘤存在肿瘤干细胞。这使得我们对肿瘤本质的认识开拓了新视角。,BGSCs存在的依据,脑胶质瘤干细胞 BGSCs 存在的依据： 基于肿瘤干细胞的研究学说，在BGSCs
6、研究方面，Singh等首先报道以CD133为标志物，用免疫磁珠法从不同类型的新鲜胶质瘤标本中分离出一小部分与神经干细胞相似的肿瘤细胞，在体外培养表现为： 1.失去胶质瘤的细胞贴壁生长特点，而呈与神经干细胞生长方式类似的悬浮生长球体。 2.在无血清的培养基上，能不断的进行自我更新和增殖，但不分化，维持干细胞的固有特征。 3.在血清培养基上，分化为与亲本肿瘤形态和分子表型相似的肿瘤细胞。 上述证据表明：一小部分肿瘤细胞即是BGSCs,BGSCs动物实验,Galli等建立了胶质母细胞瘤细胞株系，证明其在体外培养情况下能自我更新，增殖及分化形成多种细胞系细胞，1.将形成肿瘤球分离后，植入裸鼠的脑内能形
7、成与亲本同样的胶质瘤2.而从该鼠的胶质瘤分离出来的BGSCs再次移植到第2只裸鼠脑内，又能形成跟第一代小鼠及亲本同样的胶质瘤 用C6胶质瘤细胞株及人髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤进行试验也得到了相似结果。后者发现：移植100个CD133+细胞（BGSCs）即能形成肿瘤，而移植0.5-1*106个CD133-细胞，即普通肿瘤细胞，即能在注射部位形成胶质瘢痕。 该结果不仅证明了BGSCs的干细胞属性，也证实了只有CD133+的胶质瘤细胞属于BGSCs，该发现使我们对胶质瘤的生成细胞起源有了深入的认识。,BGSCs的来源,1.神经干细胞和祖细胞：来源于可以自我更新的正常干细胞； 或者经过基因突变获得自我更
8、新的祖细胞 神经干细胞源性：神经干细胞与肿瘤细胞非常类似，只要轻微的突变，即可获得强化的无限增殖能力，产生肿瘤，也即：神经干细胞或者神经前体细胞中某些基因的突变或者异常激活，可能抑制其正常分化而导致肿瘤形成，相关实验验证：1.Kenney等使小脑外颗粒层干细胞内的抑癌基因Rb高度磷酸化而失活，可诱导形成髓母细胞瘤2. Holland在以nestin-TVA小鼠为模型的研究中，将表皮生长因子、血小板源性生长因子基因或致癌基因Ras,AKt导入前脑nestin+细胞中能导致与人类相似的胶质瘤3.Lubensky等以放射诱导方法进行研究，结果显示：神经干细胞或者胶质前体细胞的放射损害将抑制细胞的正常
9、分化并导致肿瘤形成 etc,神经干细胞源性学说,神经干细胞作为基因治疗载体时有趋向胶质瘤的特征，说明两者间存在特殊的渊源关系。 相关实验：1.Aboody等将神经干细胞植入荷瘤鼠肿瘤局部，脑内远隔肿瘤部位甚至仅采用尾静脉注射，神经干细胞均可穿越正常组织进入肿瘤组织内生长，并随肿瘤细胞向其他部位迁移。2.HEESE等在体外进行试验中也发现类似神经干细胞趋向胶质瘤细胞的现象,神经干细胞源性学说,神经干细胞和BGSCs在细胞抗原表达，培养条件和信号通路等方面也有许多相同或相似之处相关实验佐证：1.在抗原表达方面，神经干细胞表达的众多抗原也为BGSCs所表达，包括Nestin CD133 musash
10、i-1,bmi-1等；2.在培养条件方面，神经干细胞与BGSCs在无血清培养时均呈球形悬浮生长，需要相同的生长因子维持；3.在信号通路方面，神经干细胞和BGSCs的增殖，分化和凋亡均通过Notch,Wnt,Shh,Bcl-2和第10染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因（PTEN)等信号分子调控可见，BGSCs在生物学特性上与神经干细胞非常相似，BGSCs起源于神经干细胞转化形成的可能性非常大。,脑胶质瘤干细胞体外培养神经球,神经干细胞源性学说,神经干细胞较成熟胶质细胞更容易转化形成BGSCs的可能原因包括：1.神经干细胞是未分化的幼稚细胞，在转化过程中较成熟细胞可以减少一个脱分化的过程，也就是
11、说，相比成熟细胞，神经干细胞只需要更少的突变就可以转化为GSCs2.神经干细胞有更长的生命周期，因而更容易积累各种致癌性突变的变异发生转化。,神经祖细胞源性学说,初步分化的神经祖细胞源性： 假设基因改变能使初步分化的祖细胞重新获得自我更新分化的能力，则它也可能成为癌变发生的对象。 相关研究：1.在小鼠和人，在用TVA系统进行的研究中，转导基因进入GFAP+的胶质前体细胞和nestin+神经干细胞均能导致胶质瘤；2.在GFAP启动子控制下表达原癌基因Ras或者SV40T抗原在大多数动物中也能导致胶质瘤，而以S100-B为启动子表达v-erbB基因的转基因小鼠则可导致少突胶质细胞瘤。etc.这些研
12、究提示：初步分化的祖细胞也可能是基因转化的靶点。 由于目前证明GFAP和S100-B在神经干细胞中也可表达，因此，有必要寻找更为特异性的神经干细胞和祖细胞的标志物以确定BGSCs的细胞来源。,融合细胞学说,2.融合细胞来源：在肿瘤研究中发现，在促融合因子 例如：CD44,CD48,巨噬细胞融合受体,IL4等 的作用下，会发生一系列的细胞融合反应：即： 肿瘤细胞间/肿瘤细胞和正常细胞(包括干细胞)间在促融合因子作用下发生细胞融合导致遗传物质重新组合融合细胞获得新的生物学特性 具体到脑胶质瘤干细胞，IL4在神经胶质瘤里高表达，其介导的融合细胞可能是胶质瘤干细胞的一个来源。,水平基因传递学说,3.水
13、平基因传递学说：遗传物质从一个细胞转移到另一个非其子代的细胞中的过程称为水平基因传递(horizontal gene transfer，HGT)，一些“危险基因”可以通过此途径在不同种属间传递，真核细胞可以通过细胞吞噬和吞饮过程来完成水平基因传递 研究发现：p53缺失的成纤维细胞吞噬肿瘤细胞的凋亡小体后可在体外形成克隆集落 在体内，致瘤肿瘤细胞本身就具有很强的吞噬和吞饮功能 因此，通过水平基因传递途径也可能产生肿瘤细胞及肿瘤干细胞,BGSCs的生物学特性：,BGSCs作为干细胞的一种，显然具有干细胞的一般特性，即：自我增殖 自我多向分化 终身增殖分化 1.归巢行为：干细胞龛：干细胞生长时，会在
14、其周围形成特定的微环境，由细胞、细胞外基质、细胞因子、生长因子等构成，这些物质对干细胞的正常活动有重要的调控作用，这样的微环境称之为干细胞龛 （Stem Cell Niche）：具体到肿瘤干细胞，在生长中也形成龛:肿瘤干细胞脱离原发肿瘤沿血液和淋巴液内趋化因子形成浓度梯度游走远端的转移位点穿过血管和淋巴管壁定位到转移位点占据正常干细胞龛或者募集新的龛龛提供了适宜肿瘤干细胞生长的微环境，避免凋亡，完成归巢。这种肿瘤干细胞的归巢行为和肿瘤转移灶的形成密切相关,区别于NSC的生物学特性,2.区别与神经干细胞的特性： 增殖特性维持时间长； 分化成神经元样细胞经微管蛋白3和Ki-67染色显示增殖异常；
15、双阳性细胞形成；如-tubulin(神经元特异蛋白）和GFAP（胶质细胞特异性蛋白） 含血清培养基，仍能保持自我更新能力，神经干细胞则会逐渐失去自我更新能力,耐辐射性,3.耐辐射性 脑胶质瘤特别是恶性度很高的胶质母细胞瘤，对放疗手段治疗不是很敏感，且容易复发。这与胶质瘤干细胞的耐辐射性是密切相关的，相关实验也验证了：1、Bao等用平板集落形成法比较CD133+细胞和CD133-细胞 的抗辐射性发现前者在辐射下集落形成率明显大于后者。2、体内实验也表明CD133+细胞在照射剂量高达5Gy时致瘤能力才明显下降，CD133 -细胞在2Gy时就丧失了致瘤能力。这些研究都证明肿瘤干细胞具有较肿瘤细胞更强
16、的耐辐射性 相关研究现实：放射线主要损伤DN，DNA损伤修复能力是决定细胞放射敏感性的主要因素。肿瘤干细胞耐辐射机制主要是DNA损伤的高效修复有关,耐药性,4.耐药性 临床治疗中，一些原来不具有耐药性的肿瘤经化疗复发后 会获得多重耐药性。 肿瘤干细胞可以为之合理的解释：在化疗中幸存的肿瘤细胞，是肿瘤复发的直接原因，这些幸存细胞很可能就是具有较强耐药性的肿瘤干细胞 。 相关实验：秦琨等利用CCK-8法检测，发现CD133+胶质瘤细胞对替尼泊苷的耐药性明显大于CD133-细胞。 相关研究表明:BCRP1被认为是侧亚群SP细胞的特性，肿瘤干细胞属SP细胞，丰富表达BCRP1，在BCRP1的作用下，细
17、胞能泵出胞内的抗癌药物，这是肿瘤耐药的一个重要机制，,鼠模型成瘤性,5.鼠模型成瘤性Pellegatta将胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞分别注入同源鼠纹状体内，7D后发现肿瘤细胞致瘤小且局限，肿瘤干细胞致瘤广泛，浸润脑组织，向室管膜下腔迁移；生存分析:BGSCs小鼠比GCs小鼠死亡中位数高。Singhl、K o n d o 和尹昌林等从人胶质瘤组织或小鼠胶质瘤细胞系中分离得到胶质瘤干细胞 ，并在小鼠不同组织内证实了其成瘤性，表型和原肿瘤相同。肿瘤干细胞可能就是肿瘤的始发细胞之一,脑胶质瘤干细胞的分离鉴别标志,1.CD133： 是表达在人干细胞的一种表面糖蛋白抗原 CD133抗原可表达于人类多种正常干
18、细胞，也在一些恶性肿瘤干细胞中表达； 被用来作为干细胞的鉴定标志和分离工具 2.nestin: 中间丝蛋白，表达于神经干细胞和前体细胞，随着分化的加深，表达逐渐减弱，成熟的神经元内不表达。 nestin被广泛用于神经干细胞和脑肿瘤干细胞的鉴定,研究BGSCs对于胶质瘤的意义,研究脑肿瘤细胞系BGSCs对于胶质瘤的意义： 首先，从病因学角度看，在胶质瘤中只有BGSCs具有永久性、失控性的增殖能力；胶质瘤祖细胞虽然也增殖，但是数代后分化成熟和走向凋亡；而普通胶质瘤细胞对胶质瘤增殖没有影响。因此，只有作为“种子细胞”的BGSCs在脑胶质瘤的发生、发展中具有决定性作用，故研究肿瘤病因必须从肿瘤干细胞产
19、生的原因入手。 其次，从肿瘤的侵袭播散来看，肿瘤干细胞所起的作用也是主要的，从肿瘤发源地脱落，到达远处的肿瘤细胞，必须是干细胞才能产生新的病灶。,Content,从早期诊断角度来看，由于肿瘤起源于肿瘤干细胞，因此争取尽早发现体内的肿瘤干细胞，甚至在其增殖分化导致出现临床表现前（即亚临床阶段）就发现它，将使得肿瘤的诊断打大大提前，真正做到早期诊断。这就要求进一步的深入研究，找出脑胶质瘤干细胞特异性标记物，为BGSCs的早期鉴定提供依托。 从治疗角度说，任何措施治疗都要能对干细胞产生致命性效应才能治愈肿瘤。针对于胶质瘤，彻底地杀死BGSCs,特别是已发生播散的BGSCs才是治疗的根本。用于其他肿瘤
20、细胞的治疗只能在一定程度上减少肿瘤大小，“种子细胞“没有祛除，治标不治本。,目前治疗的普遍误区,当前外科手术：只能切除及侵犯邻近有限范围内的肿瘤，如果BGSCs播散转移在手术范围外，肿瘤复发则不可避免。 药物化疗及放疗主要针对增殖能力相对有限的普通肿瘤细胞，而不针对BGSCs,特别是停留于GO期的BGSCs。 因此要想治愈肿瘤，治疗措施必须围绕BGSCs来开展，研制对其敏感性高的化疗药物，并与传统的化疗药物联合使用很有可能对脑肿瘤的药物治疗带来广阔的前景。 总之，既往我们对肿瘤，特别是脑胶质瘤的发生发展和治疗研究中的不尽人意指之处，通过对肿瘤干细胞或BGSCs的深入研究，有望大为改观。,展望,肿瘤干细胞学说的提出，提供了靶向性或者选择性杀伤肿瘤干细胞的可能性。 脑肿瘤干细胞的提出和研究对脑肿瘤的基础研究与临床治疗都产生了深远的影响。 对肿瘤干细胞起源及其基因表达和调控的研究尚需进一步深入。 未来的研究热点将集中于： 1.肿瘤干细胞特异性标志物的寻找、鉴定及分离上。 2.脑胶质瘤干细胞和正常干细胞在基因表达和调控上的差异，以及对其特异性信号传导通路的探索，这些研究将为确定肿瘤特异性诊断标准及有限治疗提供有力的支持。,Thank You !,SHANMING 2011.10.26,
