1、肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,Hebei Medical University,硕士学位论文,研 究 生： 朱红霞 导 师： 牛春雨教授赵自刚教授专 业： 病理学与病理生理学,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,研究背景,肠淋巴途径在多器官损伤的发病学中具有重要作用。肾脏是失血后首先出现低灌注的器官之一。随着针对微循环学说进行的液体复苏，由缺血直接导致休克肾损伤的病例逐渐减少。但是在某些情况下不能及时进行液体复苏而导致休克肾损伤的情况依然存在，休克肾损伤引起的内环境紊乱（如酸中毒、高钾血症）、代谢产物蓄积又成为引起其它器官损伤的中间环节，成为重症休克难治的关键因素。因
2、此，对持续低血压状态下肾损伤相关机制的探讨有利于休克肾损伤的救治，具有重要的临床意义。,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,本研究通过肠淋巴液引流，观察肠淋巴液对失血性休克大鼠肾组织形态及功能的影响，并从胰蛋白酶活性、炎症反应、能量代谢等角度探讨其作用机制，进一步揭示肠淋巴途径在休克肾损伤发病学中的意义，为重症休克的防治提供实验依据。,研究目的,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,研究过程及方法,一、主要仪器设备,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,二、主要材料及试剂,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,肠淋
3、巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,三、实验步骤,实验对象,留取标本,休克组,假手术组,引流组,肾组织,全 血,ICAM-1含量,胰 蛋 白 酶 含 量,RAGE含量,ICAM-1含量,2，3-DPG含量,形态学变化,RAGE含量,TNF-含量,MDA含量,肾 功 能 指 标,LA水平,血浆,肾组织匀浆,病理切片,膜泵（ATPase),实验技术路线,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,1. Wistar雄性大鼠，随机均分为假手术组（仅麻醉与手术）、休克组（复制失血性休克模型）、休克肠淋巴液引流组（复制失血性休克模型，并于低血压1h引流休克肠淋巴液，简称“引流组” ）。所有大鼠经
4、戊巴比妥钠肌肉注射麻醉后，行股部手术，右股静脉注射肝素钠全身抗凝，右股动脉插管连接生物信号采集系统，连续监测平均动脉血压（mean artery pressure，MAP）；左侧股动脉插管后连接注射器固定于抽注机上备放血用；腹部手术，剥离肠系膜淋巴管。,具体实验步骤,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,2.待所有手术完成、稳定30 min后，休克组与引流组大鼠经左股动脉匀速放血，10 min内将MAP降至40 mmHg，实验中通过调整放血量维持MAP在（402）mmHg水平复制失血性休克模型。假手术组进行相同的手术操作，但不放血。引流组大鼠维持低血压1h后，行肠系膜淋巴管插管，引流休
5、克肠淋巴液至休克3h。,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,3.休克组维持低血压3 h、引流组引流休克23 h肠淋巴液后、假手术组在相应时间点，经腹主动脉取血，制备血浆，检测肾功能指标尿素（Urea）、肌酐（Cre）以及胰蛋白酶、细胞间黏附分子（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、晚期糖基化产物受体（receptor of advanced glycation end-products，RAGE）；,4.留取固定位置的肾组织，一部分多聚甲醛固定用于观察肾组织形态学变化；另一部分制备组织匀浆用于检测丙二醛（malondialdehyde，
6、MDA）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-，TNF-）、ICAM-1、RAGE、乳酸（lactic acid，LA）、2,3-DPG、膜泵（ATPase）等指标。,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,5、 统计学处理：计量数据以均数标准差（meanSD）表示。应用SPSS 16.0统计软件包进行方差齐性检验，方差齐（P0.10）的资料多组间比较采用单因素方差分析、两组间比较用两样本均数t 检验，方差不齐（P0.10）的资料采用Kruskal Wallis检验，进行统计学处理，以P0.05为有统计学意义。,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,结 果,
7、肠淋巴液引流对失血性休克大鼠肾损伤的作用：组织形态学观察 肠淋巴液引流对失血性休克大鼠与肾损伤相关的血浆指标的影响 肠淋巴液引流对失血性休克大鼠肾组织匀浆相关指标的影响,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,结 果, 肠淋巴液引流对失血性休克大鼠肾损伤的作用：组织形态学观察表明，假手术组肾小球、肾小管结构正常，见右图。,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,同时，休克组可见肾小管上皮细胞坏死。,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,引流组大鼠肾组织损伤较轻。,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,由右图的实验数据表明
8、：休克组大鼠血浆Urea、Cre含量均显著高于假手术组，引流组大鼠血浆Urea含量显著低于休克组；,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制, 肠淋巴液引流对失血性休克大鼠与肾损伤相关的血浆指标的影响：,a、休克组大鼠血浆胰蛋白酶活性显著高于假手术组；引流组大鼠血浆胰蛋白酶活性显著低于休克组，且与假手术组比较无统计学差异。,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,b、休克组大鼠血浆ICAM-1含量（109.383.41 ng/L）显著高于假手术组（92.8810.40 ng/L，P0.05）。,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,c、休克组大鼠血浆RAGE含量（10.859
9、1.661 mg/L）显著高于假手术组（5.1042.023 mg/L，P0.05）。,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制, 肠淋巴液引流对失血性休克大鼠肾组织匀浆相关指标的影响：,a、休克组大鼠肾组织匀浆ICAM-1含量（41.533.58 ng/g.protein）显著高于假手术组（32.765.90 ng/g.protein，P0.05） ；,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,b、休克组大鼠肾组织匀浆MDA含量（2.1840.614 nmol/mg.protein）显著高于假手术组（1.0770.248 nmol/mg.protein，P0.05） ；,肠淋巴液引流
10、减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,c、休克组大鼠肾组织匀浆TNF-含量（389.9923.90 ng/g.protein）显著高于假手术组（298.7626.85 ng/g.protein，P0.01） ；引流组大鼠肾组织匀浆TNF-含量（355.0037.71 ng/g.protein）显著低于休克组（P0.05） ，且高于假手术组（P0.01） ;,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,d、休克组大鼠肾组织匀浆RAGE含量（3516.85313.22 ng/g.protein）显著高于假手术组（2728.18369.12 ng/g.protein，P0.01） ；引流组大鼠肾组织匀
11、浆RAGE含量（3159.99173.75 ng/g.protein）显著低于休克组（P0.05） ，且高于假手术组（P0.05） ;,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,e、休克组大鼠肾组织匀浆2,3-DPG含量（0.8180.078 mol/g.protein）显著高于假手术组（0.6050.108 mol/g.protein，P0.01） ；引流组大鼠肾组织匀浆2,3-DPG含量（0.9330.085 mol/g.protein）显著高于休克组与假手术组（P0.05，P0.01） 。,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,f
12、、休克组大鼠肾组织匀浆LA含量（0.8850.107 mmol/g.protein）显著高于假手术组（0.5310.038 mmol/g.protein，P0.01） ；引流组大鼠肾组织匀浆LA含量（0.6740.084 mmol/g.protein）显著低于休克组（P0.01） ，且高于假手术组（P0.01） 。,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,g、另外，肠淋巴液引流对失血性休克大鼠肾组织匀浆ATPase活性也会产生影响，检测结果表明：假手术组、休克组、引流组三组大鼠肾组织匀浆Na+-K+-ATPase、Ca2+ -ATPase、Mg2+-ATPase、Ca2+-Mg2+-AT
13、Pase活性均无统计学差异（P0.05），见下表。,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,进一步探讨,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,本研究针对持续低灌注后的AKI，从肠淋巴液回流角度进一步探讨AKI的发病机制与干预措施。1、研究发现，休克后肾组织结构发生损伤，血浆Urea、Cre含量增加。说明持续低灌注引起了AKI，Urea、Cre含量增加的原因一方面可能因肾功能降低所致，另一方面可能与低血压引起的高代谢有关。而休克13h肠淋巴液引流则减轻了肾小管上皮细胞的坏死程度，降低了休克组大鼠血浆Urea含量。结果提示，休克肠淋巴液引
14、流减轻了持续休克状态大鼠的AKI。但也发现，肠淋巴液引流没有降低血浆Cre水平，其主要原因可能为，尽管休克引起了Urea、Cre水平增高，但Cre仍在正常范围内，故对Cre的清除作用不明显。,2、胰蛋白酶为蛋白水解酶，细胞损伤后大量胰蛋白酶释放，可继续引起细胞组织蛋白的裂解，加重细胞损伤。因此，胰蛋白酶可作为细胞损伤程度的标志物。通过检测血浆胰蛋白酶活性发现，休克组大鼠血浆胰蛋白酶活性增高，过高的胰蛋白酶既是休克后细胞损伤的结果，又是加重细胞损伤的机制；引流休克肠淋巴液则降低了血浆胰蛋白酶活性，一方面可能与休克肠淋巴液引流减少了休克肠淋巴液中毒性物质对细胞的损伤，也可能与休克肠淋巴液中胰蛋白酶
15、的回流有关，这一点还有待进一步证实。,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,3、ICAM-1分布于内皮细胞、上皮细胞、单核细胞、淋巴细胞等，在失血、创伤等应激因素作用下，可快速表达合成，成为中性粒细胞与血管内皮黏附的重要因素，进一步加重炎症反应与微循环障碍。本研究发现，持续低血压3h后，血浆及肾组织匀浆ICAM-1均升高。血浆中过高的ICAM-1引起中性粒细胞与血管内皮黏附，活化的中性粒细胞则进一步释放大量的炎症介质与自由基；肾组织匀浆中过高的ICAM-1可增加中性粒细胞在肾组织的扣押，加重肾组织的炎症反应与自由基损伤；这与我们随后观察到肾
16、组织TNF-、MDA含量增高是一致的。行休克肠淋巴液引流的大鼠血浆与肾组织匀浆的ICAM-1含量均显著降低，且与假手术组比较无统计学差异。,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,说明休克肠淋巴液引流有效降低了ICAM-1水平，从而减轻了肾组织细胞的炎症反应与自由基损伤.这与引流组大鼠肾组织TNF-、MDA的变化一致 ，研究结果也提示休克肠淋巴液引流减轻肾损伤的作用机制与降低ICAM-1及其随后的炎症反应与自由基损伤有关。同时，实验还发现，休克肠淋巴液引流虽然降低了肾组织TNF-水平，但仍高于假手术组，说明还有其它的机制引起了TNF-水平的增
17、高。为此，本研究进一步观察了RAGE的变化。,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,4、RAGE的分布具有组织特异性，主要集中于外周血单核-巨噬细胞系统、血管内皮细胞、肺泡上皮细胞、神经元细胞、肿瘤细胞等组织中。是免疫球蛋白超家族的一个多配体成员，属细胞表面受体，具有与晚期糖基化终末产物（advanced glycation end-products, AGEs）结合的能力。RAGE与AGEs结合后可引起一系列的组织损伤，是多种炎症介质引起炎症反应、造成组织损伤的中间环节。尤其是参与了内毒素、失血等因素导致的急性肺损伤。本研究发现，休克后大
18、鼠血浆及肾组织匀浆RAGE水平显著升高；休克肠淋巴液引流则降低了大鼠血浆及肾组织匀浆RAGE水平，说明休克肠淋巴液引流减轻肾损伤的作用机制与降低RAGE有关。,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,5、除了炎症反应与自由基损伤以外，肾脏持续低灌注引起的缺血性损伤在休克肾的发病学中应该发挥着更为重要的直接作用。为此，本文观察了休克肾组织与氧供相关的2,3-DPG以及LA含量的变化。由于RBC内2,3-DPG水平是影响Hb与氧亲和力的重要因素，2,3-DPG水平下降，使Hb与氧亲和力增加，不利于组织氧供；2,3-DPG水平升高，降低Hb与氧的亲
19、和力，有利于组织供氧。研究发现，休克后2,3-DPG水平均显著高于假手术组，说明休克后肾组织血液循环中RBC对于组织的供氧能力是增强的，这可能为机体的代偿性反应；,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,但肾组织LA水平仍高于假手术组，说明尽管红细胞供氧能力增强，仍没有完全纠正肾组织细胞的氧供，无氧代谢仍强。而引流休克肠淋巴液后，2,3-DPG水平进一步升高，加大了肾组织血液循环的氧供，这对于组织细胞的有氧代谢是有利的。也从另一个侧面说明休克肠淋巴液回流至体循环降低了红细胞供氧能力的代偿作用；而LA水平下降也说明了引流休克肠淋巴液恢复了肾组织
20、细胞的有氧代谢。可见，引流休克肠淋巴液减轻肾损伤的作用机制与改善肾组织细胞的氧供、有氧代谢增加有关。,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,6、ATPase为依赖ATP的膜结合蛋白酶，存在于组织细胞及细胞器的膜上。它们对建立跨膜的离子梯度、维持细胞膜电位、容量、体温、代谢以及营养的转运等生理活动具有重要作用。细胞的损伤程度与膜ATPase活性高低密切相关，提升组织细胞膜泵活性有利于器官保护。鉴于组织细胞膜ATPase在组织细胞损伤中的重要作用，本研究观察了肠淋巴液引流对休克大鼠肾组织细胞膜泵活性的影响。但是结果发现，三组大鼠肾组织匀浆的Na
21、+-K+-ATPase、Ca2+ -ATPase、Mg2+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性均无统计学差异。究其原因一方面可能与肾组织细胞对缺血的代偿反应有关，也可能与本文所观察的时间仅为3h有关，因此，需要在以后的研究中进一步观察。 总之，持续低血压状态后的肾损伤与休克肠淋巴液回流有关。,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,结 论,研究结果表明，休克肠淋巴液引流可减轻持续失血性休克状态大鼠的肾损伤。其作用机制为：一、与降低血浆胰蛋白酶活性、降低ICAM-1、RAGE、TNF
22、-引起的 炎症损伤、降低自由基损伤有关；二、与提高氧释放能力从而改善能量代谢、减轻乳酸性酸中毒有关。总之，持续低血压状态后的肾损伤与休克肠淋巴液回流有关，以休克肠淋巴液为干预靶点，对于重症休克肾损伤的防治具有重要的意义。,致 谢:在此论文完成之际，我真诚地向帮助过我的老师、同学和朋友们表示衷心的感谢！首先我由衷地感谢我的导师牛春雨教授、赵自刚教授对我课题研究的殷切教诲和精心指导。本论文是在牛春雨老师、赵自刚老师、张静老师的亲切关怀和指导下完成的，从论文的选题、提纲的制定、实验的运作到最后的定稿，无不凝聚着他们的心血和汗水。她们严谨的治学态度，诲人不倦的育人精神，精益求精和求实创新的科研作风，将
23、是我今后人生和工作中所追求的目标。在论文完成之际，谨向恩师们致以最诚挚的谢意。衷心地感谢韩瑞老师、邢立强老师、张玉平老师、杜会博老师及其他老师对我实验提供的指导及帮助，和对我基础知识的补充及指导！衷心地感谢张立民同学、司永华同学、刘争杰同学的全力相助！衷心地感谢河北北方学院附属第一医院检验科、病理科各位老师的帮助！衷心地感谢我的老主任苏心镜老师，我的同事鲁蓓、武永生、冯琥、郑丽君等对我完成学业的帮助与指导！最后，我要特别的感谢我的爱人及我的家人！是你们三年来给我的支持和帮助使我完成了学业，你们的爱我会永远铭记在心！谢谢你们！感谢所有未提及的曾经关心支持过我的领导、老师、同学和朋友们！,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,肠淋巴液引流减轻失血性休克肾损伤的作用与机制,汇报完毕，谢谢！,
