1、实验六 碱变性法小量制备质粒DNA,一实验目的,掌握碱变性裂解法制备质粒DNA的原理。掌握DNA分离纯化的基本操作技能。,二实验背景,质粒是细菌染色体外的环形双链DNA分子，能在宿主细胞内独立自主的进行复制。 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。大小可从1kb到200kb。,The constructed E. coli plasmid pBR322.,质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。 质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性或致育因子等。,质
2、粒类型,质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒 和 严紧型质粒松弛型质粒其复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。质粒的拷贝数通常很高，有的甚至可达2000-3000拷贝/细胞。2.严紧型质粒严紧型质粒的复制受到严格控制，其拷贝数通常很低，每个细胞内只含有1 个或几个质粒分子 。,质粒的应用,大多数基因工程使用松弛型质粒。 严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物， 这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。,-四个载体酶切图,分离质粒DNA方法,从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目
3、前常用的有： 碱变性法； 煮沸法； 羟基磷灰石层析法等各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。,差速离心（differential centrifugation）是利用不同离心速度产生的不同离心力，将沉降系数不同的各种亚细胞组分和各种颗粒分开。 用于分离大小、形状显著不同的组分，根据颗粒沉降速度不同得以分离. 特点： （1）介质密度均一； （2）速度由低向高，逐级离心。 沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高尔基体核蛋白体。 可将大小相差悬殊的细胞器初步分离，常需进一步通过密度
4、梯度离心再行分离纯化。,差速离心,dx 2r2 (p-m) V= = . 2 X dt 9 d2 (p-m) = . 2 X 18 r： 球形粒子的半径 d：球形粒子的直径 ：流体介质的粘度数 p：粒子的密度 m：介质的密度,沉降系数 Sedimentation coefficient (S),S在实际应用时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。,S是指单位离心场中粒子移动的速度。,三、实验原理 碱变性法基本原理,碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分
5、离目的。 在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，,当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构， 通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。而质粒DNA仍为可溶状态留在上清中。,四、操作步骤,分离质粒DNA的方法一般包括3个基本步骤： 培养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细菌； 分离和纯化质粒DNA。,思考题,解释操作过程中第4，5，6，7，11步的作用 解释离心,OCL CCC,1 2 3,1 pEGFP-N1 2 pEGFP-N1/HindIII 3 DNA marker,
