1、,微生物学检验,第六章细菌对抗菌药物敏感性与耐药性,本 章 内 容,学习目标,学习目标： 1掌握 抗菌药物敏感试验常用方法，纸片扩散法（K-B法）的操作方法、结果判断及实验质量影响因素 2熟悉 耐药表型检测；-内酰胺酶检测方法；超广谱-内酰胺酶（ESBLs）检测方法 3了解 临床常用抗菌药物种类；药敏试验中药物选择原则本章重点：纸片扩散法（K-B法）的操作方法及结果判断药敏试验的临床意义,第一节 临床常用抗菌药物,一、抗菌药物分类 1.-内酰胺类：抑制转糖基酶、转肽酶、D-羧肽酶、内肽酶，从而细菌细胞壁合成。 2.氨基糖苷类：抑制mRNA的转录和蛋白质的合成。 3.喹诺酮类：作用于DNA旋转酶
2、，干扰细菌DNA复制、修复和重组。 4.大环内酯类：结合细菌核糖体50S大亚基，抑制细菌蛋白质合成和肽链延伸。 5.糖肽类：阻断肽聚糖合成，阻阻碍细胞壁合成。,第一节 临床常用抗菌药物,一、抗菌药物分类 6.磺胺类：竞争性与二氢叶酸合成酶结合，使核酸合成抑制。 7.四环素类：结合细菌30S核糖体亚基，抑制蛋白质合成。 8.氯霉素类：作用细菌70S核糖体的50S亚基，抑制蛋白合成。 9.林可酰胺类：结合细菌核糖体50S大亚基，抑制蛋白质合。 10.其他抗菌药物：硝基肤喃类、硝基咪唑类、链阳霉素类、噁唑烷酮类等。,二、常规药敏试验药物选择原则我国主要遵循美国临床实验室标准化委员会（CLSI）制定的
3、抗菌药物选择原则。,第一节 临床常用抗菌药物,返回章内容,第二节 抗菌药物敏感试验,一、概述 测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药物敏感试验（AST）,菌株被推荐剂量治疗感染部位可达到的抗菌药物浓度抑制,药物在生理浓集部位有临床效果，还代表敏感与耐药之间缓冲区,菌株不能被常规剂量抗菌药物可到达的浓度所抑制,敏感（S）,耐药（R）,中介（I）,抗菌药物敏感试验结果,第二节 抗菌药物敏感试验,二、纸片扩散法 含有定量抗菌药物纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含药物吸收琼脂中水分溶解后向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制
4、，形成透明抑菌圈。抑菌圈大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关关系。,第二节 抗菌药物敏感试验,二、纸片扩散法 1.水解酪蛋白（MH）培养基，pH7.27.4，做成琼脂厚度4mm，直径90mm的平板 2.挑取孵育1624小时已分纯菌落，置于生理盐水管中，振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准,第二节 抗菌药物敏感试验,二、纸片扩散法 3.用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液 4.在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周 5.平板在室温下干燥35min，用无菌镊子或纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中
5、心距离应大于24mm，纸片距平板内缘大于15mm,第二节 抗菌药物敏感试验,二、纸片扩散法 6.平板置352孵育箱，1618小时后判读结果。苛养菌应在含5%CO2环境中培养2024小时 7.用游标卡尺或直尺量取抑菌圈直径。按照CLSI标准判读，报告敏感、中介、耐药,第二节 抗菌药物敏感试验,纸片扩散法图解,抑菌圈,细菌生长,药敏纸片,细菌菌落,抗生素浓度,耐药,敏感,第二节 抗菌药物敏感试验,三、稀释法 以一定浓度的抗菌药物与培养基进行一系列不同倍数稀释，经培养后观察被试菌株的最低抑菌浓度，根据CLSI提供的MIC解释标准判断细菌对抗菌药物的敏感程度。稀释法中使用肉汤培养基为肉汤稀释法，使用琼
6、脂培养基为琼脂稀释法,第二节 抗菌药物敏感试验,三、稀释法 1. 肉汤稀释法,第二节 抗菌药物敏感试验,三、稀释法 2.琼脂稀释法,浓度 16 32 64 128 256 g/ml,制备含对倍抗生素浓度梯度的平板，制备菌悬液，点种菌，104/每点，孵育35，1620h ，判读结果,第二节 抗菌药物敏感试验,四、E-test法 E-test法（epsilometer test）结合了扩散法和稀释法的原理和特点，对抗菌药物直接测量MIC。E试条为宽5mm、长50mm的无孔试剂载体，一面固定有浓度呈连续指数增长的抗菌药物，另一面有所含药物浓度的刻度,第二节 抗菌药物敏感试验,四、 E-test法 1
7、.菌液制备及接种均同纸片扩散法 2.于90mm平板上可放E试验试条1 2条，140mm平板最多可放6条 3. 孵育、温度及时间同纸片扩散法 4.读取椭圆形抑菌环与E试条的交界点值即为MIC,第二节 抗菌药物敏感试验,五、质量控制 1.影响纸片扩散法的因素 (1) 培养基厚度 (2) 细菌浓度 (3) 抗菌药物含量、扩散性 (4) 温度，预孵育时间 (5) 判定标准 (6) 质控标准菌株,第二节 抗菌药物敏感试验,五、质量控制 2.质量控制的要求 （1）质控菌：标准菌株来源国家微生物菌种保藏中心。标准菌株应每周在MH琼脂上传代一次，4保存 （2）质控方法：在同一条件下，将新鲜传代质控菌株用与常规
8、实验相同的测定药物进行相同的操作方法后，测定质控菌株的抑菌环，以便对照监测 （3）抑菌圈质控范围：标准菌株的抑菌圈应落在规定范围内，范围为95%的可信限,返回章内容,第二节 抗菌药物敏感试验,一、结核分枝杆菌体外药敏试验指征 首次从患者标本分离的分枝杆菌需做药敏试验，有助于临床合理用药和监测其药物敏感性。经过三个月正规抗结核治疗，标本中分枝杆菌分离培养仍为阳性的患者或重症患者，以及来自高耐药结核分枝杆菌流行区的患者，均须做体外药敏试验。,第三节 分枝杆菌的药物敏感试验,二、 体外药敏试验绝对浓度法 1.药物溶液配制 药物先制成高浓度药液，再按比例稀释成低浓度药液 .含药培养基 每100ml改良
9、罗氏培养基加入1ml配制、稀释好的抗结核药液，无菌分装7ml/管，85凝固。 .菌悬液 培养物以0.5%吐温-80生理盐水稀释，与标准麦氏比浊管No.1比浊 .接种 1mg/ml菌悬液10倍稀释至102mg/ml，无菌吸取菌液0.1ml分别接种于含药培养基和对照培养基斜面。37培养，四周观察结果,第三节 分枝杆菌的药物敏感试验,二、 体外药敏试验绝对浓度法 .结果报告 按下列方式报告对照培养基及含药培养基菌落情况：,返回章内容,第三节 分枝杆菌的药物敏感试验,一、细菌耐药性与耐药机制 1.产生一种或多种水解酶、钝化酶和修饰酶 2.抗菌药物作用靶位改变，包括青霉素结合蛋白位点、DNA解旋酶、DN
10、A拓扑异构酶的改变等 3.抗菌药物渗透障碍，包括细菌生物被膜形成和通道蛋白丢失 4.药物的主动转运系统亢进 上述四种耐药机制中，第一、二种耐药机制具有专一性，第三、四种耐药机制不具有专一性。,第四节 细菌的耐药性检查,二、耐药表型检测 1.-内酰胺酶检测 （1）-内酰胺酶是一类水解青霉素、头孢菌素类抗生素的灭活酶；该酶位于革兰阳性球菌菌体外，革兰阴性杆菌间质中。 （2）检测方法有微生物培养法、碘淀粉法、头孢硝噻吩纸片法。其中头孢硝噻吩纸片法因为简单、方便、快速，应用于临床检测。,第四节 细菌的耐药性检查,二、耐药表型检测 2超广谱-内酰胺酶检测 ESBL指由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素类
11、和单环内酰胺类氨曲南的一类酶。ESBLs不能水解头霉素类和碳青霉烯类药物，能被克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等内酰胺酶抑制剂所抑制。,第四节 细菌的耐药性检查,二、耐药表型检测 2.超广谱-内酰胺酶检测 （1）纸片扩散法表型初筛试验 出现以下一种情况即可怀疑菌株产生ESBL（筛选阳性）： 头孢泊肟17mm 头孢他啶22mm 头孢噻肟27mm 头孢曲松25mm 氨曲南 27mm,第四节 细菌的耐药性检查,二、耐药表型检测 2.超广谱-内酰胺酶检测（纸片扩散法） （1）纸片扩散法 表型确证试验 头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸。任一复合药物组的抑菌圈直径与相应单药抑菌圈直径相差5mm时，即可判断该菌产ESBL,第四节 细菌的耐药性检查,二、耐药表型检测 2.超广谱-内酰胺酶检测 （）肉汤稀释法 表型初筛试验 出现以下一种情况即可怀疑该菌株产生ESBL： 头孢他啶或头孢噻肟或头孢曲松或氨曲南MIC2mg /mL 头孢泊肟MIC8mg /mL,第四节 细菌的耐药性检查,二、耐药表型检测 2.超广谱-内酰胺酶检测 （）肉汤稀释法 表型确证试验 头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸，任何一组复合药物组的MIC值比相应单药的MIC降低3个稀释度者即可判定该菌为产ESBL菌株。,第四节 细菌的耐药性检查,返回章内容,
