1、,猪乙型脑炎及其防制研究进展,乙型脑炎及其危害 乙型脑炎病毒的病原学特性 乙型脑炎的流行病学特性 乙型脑炎的防制 乙型脑炎疫苗研制进展 乙型脑炎诊断方法研究进展 乙型脑炎病毒分子生物学研究进展 展 望,I,乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE)，简称乙脑，是一种由蚊虫传播引起的人与动物共患的急性病毒性传染病。1871年，日本。 夏秋季节流行，曾称为“夏季脑炎”。冬季曾发生过的昏睡脑炎(嗜眠性脑炎)，日本学者(1928年)。冬季 甲型脑炎，夏秋 乙型脑炎。,I,乙型脑炎,乙脑对人类危害巨大，是人类中枢神经系统(CNS)最常见的虫媒病之一，是包括印度次大陆在内的整个亚洲引起
2、人类死亡和残疾的一个主要原因 。,I,乙型脑炎的危害（人）,时 间 国 别 病 例 病死率 1924年 日本 6000 60% 1958年 越南 6897 1965年 日本 3000-5000 1999年 马来西亚,I,乙型脑炎的危害（人）,乙脑暴发流行的部分大事记,该病主要危害儿童，特别是学龄儿童，在新加坡曾有12岁儿童感染率高达70%的报道。 40-45岁的成人也易感。怀孕妇女感染后导致流产。 全球每年感染乙脑人数超过1千万，大多数呈隐性感染(亚临床感染)，其发病率一般为1:25-1:1000，平均为1:200。病死率高，平均为20%，国外有的地方高达50%-60%，全球每年病死人数超过1
3、万人。 后遗症严重，约57%-68%的治愈者患有不同程度的神经学后遗症。,I,乙型脑炎的危害（人）,多种动物如猪、马、牛、山羊、绵羊、猴和家禽很易感染乙脑，其它如兔、大鼠、鸽、犬、鸭、野禽和爬行类也易感，小鼠和某些蜥蜴能被实验感染。其临床症状随患病动物的种类不同而异，牛、羊、家禽多为隐性感染，马可发生严重的脑炎。,I,乙型脑炎的危害（动物）,猪主要表现为：潜伏期3d-4d，仔猪脑炎，高热稽留，精神沉郁，步行踉跄，最后身躯麻痹而死；育肥猪持续高热；妊娠母猪主要表现为流产，产出大小不等的死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔；公猪单侧或两侧性睾丸肿大，局部发热，有痛感，数天后，睾丸肿胀消退，逐渐萎缩变硬。
4、此病引起的主要经济损失是怀孕母猪发生繁殖障碍，对作为畜牧业支柱产业养猪业的持续增产造成巨大的危害。,I,乙型脑炎的危害（猪）,乙脑病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)的分离和鉴定最早报道于1935年（日本）。 黄病毒科(Flaviviridae)。3个血清型：JaGAr, Nakayama和Mie(intermediate type)，它们具有不同的生物学特性，包括生长特性和毒力。 JEV毒粒呈球形，20面体对称，有囊膜，毒粒直径为45 -50nm(核心30nm)，沉降系数200S，其分子量约为3000KD，是黄病毒科66个成员中最小的病毒之一。 JEV在环
5、境中不稳定，易被灭活。,I,乙型脑炎的分类及理化性质,JEV囊膜外表有穗状突起，提纯的穗状突起具有血凝活性，其成分为糖蛋白。其血凝素有轻重两种，血凝性与毒力相关，血凝性是JEV强毒株的共性，减毒毒株的血凝性相当低，甚至完全丧失。 JEV的血凝谱比较广，在一定条件下能凝集鹅、鸽、雏鸡、绵羊等动物的红细胞，但其血凝素易于破坏而且血凝反应要求比较严格的pH域。不同毒株血凝反应的最适pH不完全相同。,I,血凝特性,JEV的抗原性较强，自然或人工感染的动物一般都能产生较高效价的中和抗体、血凝抑制抗体和补体结合抗体。,I,抗原性,JEV可在多种原代和传代细胞上增殖。鸡胚成纤维细胞、鼠胚肌和肾细胞、牛胚肾细
6、胞、人胚肺和肾细胞、人羊膜细胞、猪肾原代细胞、狗肾原代细胞(PDK)、白纹伊蚊细胞(C6/36)、金黄地鼠肾原代细胞(Primary Hamster Kidney, PHK)、BHK-21、PK-15、Hela、Vero等。 JEV在PHK、猪肾原代细胞、BHK-21和Vero上可增殖到较高的滴度，而且有明显的细胞病变(CPE)，其特点主要是圆缩和脱落 。 目前国内外用于增殖JEV的细胞主要有PHK，BHK-21和鼠脑。,I,增殖特性,致病机制,I,Reported JE cases by countries and regions where viral transmission is pr
7、oven or suspected,I,流行范围,乙脑的流行在热带地区无明显的季节性，而在温带和亚热带地区则有严格的季节性。据我国多年统计资料，约有90%的病例发生在7、8、9三个月内，流行高峰华中地区多在7-8月，华南和华北地区由于气候特点，流行较华中提早或推迟1个月。云南省的流行高峰也较华中推迟1个月。,I,流行季节,Transmission cycle of JEV,I,传播循环,乙型脑炎的防制,灭蚊是控制乙脑流行的一项重要措施药物灭蚊法、生物学和生态学灭蚊法 免疫接种是一种最有效的预防措施猪是JEV的扩增动物，预防猪感染本病是防止人患乙脑的重要措施，在蚊虫活动季节开始前1个月或配种前1
8、个月注射疫苗。,I,乙脑的治疗没有特殊的方法，主要是对症治疗。其主导性防制措施防蚊灭蚊与免疫接种。,Japanese encephalitis vaccines for human Vaccine Description Substrate Strain(s) Manufacturer(s) inactivated mouse brain Nakayama, India(1) , Japan(7) , Korea(1),P1 Taiwan(1), Thailand(1), Vietnam(1) inactivated PHK P3 China: Beijng,Shanghai,Changchu
9、n live,attenuated PHK SA14-14-2 China: Chengdu and Wuhan,I,人用乙脑疫苗,疫 苗 基 质 效 力 副 作 用 价 格灭活 鼠 脑 2-3 ， 95% 强烈：触痛 红肿 20% 高轻度全身症状10-30% (头痛 肌痛 发热 胃肠道）全身性荨麻疹 面部血管性水肿 呼吸窘迫 0.6% 灭活 PHK 2-3 ， 90% 轻微：肿胀4% 头痛1% 高发热6% 疹减毒、活 PHK 1 ， 80-100% 少见：头痛0.03% 发热0.46% 低恶心0.03% 疹0.08%,I,3种疫苗的比较,人用乙脑疫苗,Virulent parent viru
10、s SA14Isolated from mosquitoes in China11 passages in newborn mice100 passages in PHK cell culture3 plaque purificationsIrradiation by u.v. and plaque purification in PHK cellsClone12-1-7First attenuated variant6 animal passages6 plaque purifications SA14-2-8SA14-5-35 passages in suckling mice2 plaq
11、ue purifications in PHKSA14-14-2/PHK9 passages and plague purificationsin PDK cell cultureSA14-14-2/PDK,I,疫苗毒株的传代减毒过程,日本有2种活疫苗供兽用。一为M株，经胎鼠皮肤培养传代致弱，供猪用，亚洲其它国家有的也用此苗；一为ML-17株，JaOH0566株经3733302725减毒而获得。 我国目前猪用乙脑疫苗主要是鼠脑灭活疫苗，该苗具有注射剂量大、需多次注射、效果不稳定及免疫力不持久等不足之处。,I,兽用乙脑疫苗,亚单位疫苗 重组活疫苗 核酸疫苗,I,发展中的乙脑疫苗,森田公一等(日本
12、，1991)用JEV E基因C-末端1/3长度cDNA片段的原核表达产物免疫小鼠，发现该融合蛋白能诱导小鼠产生抗JEV抗体，且对100PFU JEV攻击的保护率为100%(8/8)。 刘金华等(1998)用昆虫细胞(sf9) 表达的prM-E蛋白免疫2头猪，每头2mL，2周后加注1mL。第2次免疫1周后，HI抗体为2，2周为8，3周达到16。,I,乙脑亚单位疫苗,I,乙脑重组活疫苗,List of live virus-vector vaccine of JEV,I,病原学方法,病毒分离鉴定 反向被动血凝试验(RPHA) 免疫细胞化学法 荧光抗体染色法 RT-PCR,乙型脑炎的诊断,I,血清学
13、方法,补体结合试验(CT) 血凝抑制试验(HI) 中和试验(NT) 乳胶凝集试验(LAT) 酶联免疫吸附试验(ELISA),乙型脑炎的诊断,I,AUG,JEV genome structure,(11kb),乙型脑炎病毒的分子生物学,I,乙脑病毒的蛋白及其功能,NS4、NS5 N末端和C末端 AA序列，功能 新型疫苗基因疫苗 重组活疫苗 感染性全长cDNA克隆黄庆生等(2000) JEV SA14 致病机理、减毒机制、基因组功能,I,研究展望,猪乙型脑炎减毒活疫苗研究,以原代地鼠肾(PHK)细胞为培养基质研制出了猪用乙脑冻干减毒活疫苗，解决了我国目前还没有国家正式 批准的猪用乙型脑炎弱毒疫苗，
14、满足生产急需。 该疫苗对小白鼠和妊娠母猪的安全性良好。该苗能在小鼠和仔猪体内引起特异性免疫应答。疫苗在-20的保存期至少为2年，在4-8可保存1年半。,II,II,几批疫苗冻干前后效价的检测,疫苗安全性试验结果,II,疫苗免疫鼠抗体水平检测 ( LAT ),批 次,II,减毒活疫苗免疫鼠细胞免疫水平检测,S I,II,剂量 猪号 免前 免 后(周 ) 1 2 3 4 5 6 7 8 1mL 27 - - 1:1 1:4 1:1 1:16 1:8 1:4 1:4 37 - - 1:1 1:4 1:4 1:4 1:4 1:1 1:2 2mL 17 - - - 1:4 1:8 1:8 1:32 1:
15、4 1:4 47 - 1:1 1:1 1:8 1:8 1:16 X X X 3mL 57 - 1:1 1:1 1:8 1:8 1:8 1:8 1:2 1:1 67 - - 1:1 1:8 1:4 1:16 1:64 1:16 1:32 对照 77 - - - - - - - - -87 - - - - - - - - -97 - - - - - - - - -,疫苗免疫40日龄仔猪的抗体应答（LAT）,II,疫苗不同保存条件下TCID50测定,乙型脑炎及病原学特征,乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)，又称日本乙型脑炎(简称乙脑)，是一种严重威胁人畜健康的急性病毒性蚊媒
16、传染病。此病主要在夏秋流行，属于自然疫源性疾病，病毒通常在蚊猪易感动物间循环。该病是我国及亚州地区的一种严重传染病，我国除少数省，自治区外，大部分地区都有JE流行。在我国三带喙库蚊是JE的主要传播媒介，猪是主要中间宿主和扩散宿主。,乙脑对人类的危害 ：死亡、残疾 患者症状：高热、狂暴或沉郁等神经症状为主要特征 其临床表现 ：潜伏期5d-15d，病程可分为3个阶段：初期、急性脑炎期、恢复期 。,乙脑对猪的危害：引起妊娠母猪流产，产死胎、木乃伊胎、畸形胎及弱仔；使公猪单侧或两侧性睾丸肿大，发热继而萎缩变硬。 牛、羊及家禽多为隐性感染，马可发生严重的脑炎,JE的病原为乙脑病毒(Japanese en
17、cephalitis Virus,JEV) JEV原属于报膜病毒科(Tongaviridae)乙组虫媒病毒的黄病毒属(Flavivrius) 1984年另立为黄病毒科(Flaviridae) JEV分三个清型：JaGAr,Nakayama和Mie(intremediate type) JEV粒子呈球形，呈20而体对称，有囊膜，毒粒直径为45nm-50nm(核心30nm)，是黄病毒科最小的病毒之一,JEV在环境中不稳定 10%灭活兔血清和0.5%乳白蛋白水解物等对病毒有较好的保护作用 JEV大多数毒株能凝集鹅、鸽及初生雏鸡的红细胞，pH以6.5-6.8最适宜 乙脑病毒可在7-9日龄的鸡胚和多种组
18、织培养细胞内增殖 通常只在仓鼠肾细胞、猪肾和羊胎肾细胞上恒定地引起细胞病变(CPE),乙脑病毒的分子生物学研究进展,JEV为单股正链RNA病毒，基因组长11Kb，沉降系数为42S，具有感染性 整个基因组由5端非编码区(5-noncoding region,5NCR)，一个几乎跨越整个基因组的单一开放阅读框(ORF)和3端非偏码区(3-NCR)构成，无亚基因组结构 ORF大小为10.3Kb，共编码约3430个氨基酸基 ORF编码1个多聚蛋白前体,C蛋白起调节蛋白和保护基因组免受核酸酶破坏的作用，与病毒的复制和生物合成密切相关 M蛋白参与病毒的感染过程，它能诱生具有轻度中和作用的抗体 E蛋白为主要
19、结构蛋白，该蛋白在大多数黄病毒中是保守的，它是毒粒表面的重要成份，由它形成的表面抗原决定簇具有血凝活性和中活作用，能刺激机体产生血凝抑制抗体和中和抗体，可保护机体免受病毒的攻击，与病毒的吸附，侵入，致病和诱导缩主的免疫应答等作用密切相关,NS1为分泌型糖蛋白，其具体功能不清，但认为其参与病毒复制的早期阶段,NS1还可能参与病毒的组装和释放，是主要的抗原成份之一。NS1蛋白不组成毒粒，所以没有中和活性和血凝抑制活性，但它具有可溶性补体结合活性，可在不出现中和抗体的情况下诱生保护力，即不产生抗体依赖性增强作用，NS1的基因和表型具有高度同源性 NS2蛋白可能与膜功能相关 NS3蛋白在病毒感染细胞中
20、对病毒RNA的复制具有十分重要的功能 NS5可能参与病毒RNA聚合酶的组成,乙脑的防制及乙脑疫苗的研究进展,乙脑的治疗没有特效方法，除采取一般措施外，主要是对症治疗。 本病主导性防制措施是灭蚊和免疫接种 人用乙脑疫苗:鼠脑灭活疫苗，原代地鼠肾灭活疫苗和原代地鼠肾减毒活疫苗 兽用疫苗主要有减毒活疫苗和鼠脑灭活疫苗 新一代的乙脑疫苗：亚单位疫苗，重组活疫苗和核酸疫苗,2.2 乙脑酶联免疫吸附试验,乙脑ELISA抗原的制备,将病毒分别接种于9日龄鸡胚的尿囊腔中，37进行培养48小时后收集尿囊液。 离心弃沉淀。 上清用冷丙酮沉淀，离心后沉淀冷冻抽干,加入生理盐水溶解，上清作为病毒抗原。对照抗原用同样方
21、法获得。,ELISA最佳反应条件的确定,病毒抗原及对照抗原分别横行稀释包被奇数列和偶数列包被过夜。 将血清纵列稀释，37 反应1h 加入1:8000兔抗猪酶标抗体，37反应1h 加入OPD底物反应15分钟 加入 2M H2SO4终止反应。 在490nm波长下测定OD值。以阳性血清OD差值大幅度减少时的抗原稀释度为最佳包被浓度，以阳性血清OD差值大幅度减少及阴性血清OD差值很低的血清稀释倍数为血清最佳稀释倍数。,ELISA阳性界限的确定,检测92份HI检测为阴性的血清，阴阳性临界值以2.1S/P求得。 S=(病毒抗原包被孔测得血清OD值-对照抗原包被孔测得血清OD值)的平均值，P=病毒抗原包被孔
22、测得阳性血清OD值-对照抗原包被孔测得阳性血清OD值。 定性：S/P阳性界限判为阳性 定量：S/P阳性界限的血清最高稀释倍数作为效价。,ELISA方法的检验,特异性试验 重复性试验 对比试验 敏感性试验 阻断试验,4.3乙脑间接ELISA方法,在确定最佳反应条件时，考虑到了三个因素，阳性血清稀释倍数影响OD差值的情况，阴性血清稀释倍数影响OD差值的情况。 以HI检测为阴性的92份血清为参考初步确定了阳性标准。用阳性血清来参比，减少操作误差。 采用OD值之差作为病毒蛋白抗原与血清反应产生的OD值，消除对照抗原的影响。为了减少反应时间不同造成的误差，将病毒抗原和对照抗原包被在同一块酶标板上奇数及偶
23、数列。 ELISA与HI、 ELISA与LAT检测结果,3. 结果与分析,3.1日本乙型脑炎乳胶凝集试验结果与分析,3.1.1乙脑乳胶抗原最佳致敏条件的选择,最佳致敏浓度：抗原1:32倍稀释，蛋白含量为0.339mg/mL。 最佳致敏时间：30min 最佳致敏温度：37,3.1.2特异性试验及重复性试验,特异性：乙脑乳胶抗原与pH7.4PBS无自凝；与乙脑阳性血清凝集；与乙脑阴性血清、牛血清、猪布氏杆菌、猪衣原体、猪细小病毒、猪伪狂犬、猪繁殖与呼吸综合征、猪萎缩性鼻炎阳性血清不凝集。 重复性：批內及批间检测结果基本一致。,3.1.3乙脑LAT与HI的对比试验,经统计分析差异不显著(P0.05)。,HI + - 合计 阳性率 % LAT + 56 6 62 66.0 - 5 27 32 合计 61 33 94 阳性率% 64.9 符合率% 88.3,3.1.4乙脑乳胶凝集抗原保存期试验,0-4可保存一年以上, 室温可保存二个月,表明乙脑乳胶抗原便于保存和运输。,3.1.5乙脑送检血清检测结果,用乳胶凝集试验检测了1613份送检血清，其中阳性份数652份，阴性份数961份；阳性率为40.4%。,图1： 血清乙脑抗体在不同月份的阳性率情况,II,
