1、基因芯片大攻略基因芯片按应用领域主要分以下几类，用于基因组研究的 SNP 和 CNV 芯片；用于 mRNA 表达研究的基因表达谱芯片；用于转录调控研究的 microRNA 芯片和 LncRNA 芯片；以及用于表观遗传研究的 DNA 甲基化芯片。目前世界上主流的芯片制造商主要有 4 几家，分别是采用第二代基因芯片技术的美国 affymetrix 公司、美国 agilent 公司和 ROCH nimblegen 公司，以及采用第三代基因芯片技术的美国 illumina 公司。在 SNP 芯片研究领域，美国 illumina 公司毫无疑问是霸主，illumina 公司凭借自己开发的GoldenGat
2、e 技术和 infinium 专利技术一直在 SNP 芯片领域处于垄断地位。虽然 affymetrix公司也有 SNP 芯片，但无论是从芯片的技术水平、发表的文章数量和芯片的种类以及覆盖SNP 位点的数量都没法和 illumina 相比，已发表的 GWAS 文章 90%以上都是使用 illumina的 SNP 芯片。至今 affymetrix 只有人的 SNP5.0、SNP6.0、Axiom 这 3 款芯片，种类少得可怜，而且覆盖位点数量最多的 SNP6.0 芯片仅可检测 90 万个 SNP 位点，并且是 2007 年上市的。随着 Hapmap 计划和千人基因组计划如火如荼的进行，illumi
3、na 公司每年都会发布好几款新的 SNP 芯片，至今已有几十款产品，覆盖位点数量从 6000 个到 500 万个不等。包括人、大鼠、小鼠、牛、马、羊、猪、犬、鸡、玉米、苹果、桃子等十来个物种，其中仅人的 SNP 芯片就有十几款（停产的芯片不算） ，最多覆盖位点数量可达到 500 万个。并且illumina 还可以提供灵活快捷的定制 SNP 芯片，适用于大样本量分析。Illumina 和 affymetrix 的 SNP 芯片都可用于 CNV 分析，但 illumina 芯片因覆盖位点数量较多，所以在CNV 分析中可提供更高分辨率的 CNV 数据。在基因表达谱芯片领域，affymetrix 表达
4、谱芯片无论是从知名度、发表的文章数量、芯片物种种类都是 NO.1，因 affymetrix 的表达谱芯片上市时间最早，所以知名度和用户也是最多的，价格也是最贵的。但 affymetrix 表达谱芯片也有两个致命的缺陷，第一是探针太短，只有 25 个碱基，直接导致芯片检测的灵敏度太低，不利于检测低丰度的转录本。为了保证灵敏度和特异性的最佳平衡，除了 affymetrix 外，其他各大芯片制造商的芯片探针长度都是在 60-80 个碱基范围。只有 affymetrix 因芯片技术水平较落后，没办法合成长度更长的探针。还有一个缺点是芯片使用的数据库版本太旧，affymetrix 的人全基因组表达谱芯片
5、（U133 plus2.0）使用的数据库是 2001 年的 UniGene(Build 133)，至今已十多年的时间了，芯片从未更新过。可能是因为 affymetrix 的表达谱芯片种类太多，如果全部更新数据库，投入的费用和工作量太大。在基因表达谱芯片领域，agilent 公司和 illumina 公司的产品也非常不错，虽然知名度没有 affymetrix 的高，但他们也有各自的特点。Agilent 的表达谱芯片种类也非常丰富，最新 G3 版全基因组表达谱芯片有一个创新点就是芯片不仅可检测41000 个转录本，还可检测 7,419 条 lncRNA（长链非编码 RNA） 。但 Agilent
6、的表达谱芯片也有一个较大的缺点，就是芯片重复性较低，因 agilent 的全基因组表达谱芯片采用的是8*60K 的规格，每个样本只有 6 万个点来检测，平均一个转录本只有一个点，芯片内部没有技术重复，所以 agilent 的全基因组表达谱芯片的重复性在所有的芯片中是最差的。Illumina 的基因表达谱芯片采用的是更先进，密度更高的第三代基因芯片技术，因此illumina 的全基因组表达谱芯片是目前唯一一种可以达到探针 30 倍重复的表达谱芯片，其他的芯片都只能达到 1-8 倍技术重复。因此 illumina 的全基因组表达谱芯片的重复性是所有芯片中最高的，其重复性 R20.996，并且基于第
7、三代基因芯片独特的微珠芯片生产工艺，芯片生产成本较低，信噪比和灵敏度都非常高，其灵敏度1:250,000，芯片检测结果和 qPCR 相关系数 R2=0.97。但缺点是 illumina 的基因表达谱芯片只有人、大鼠、小鼠这三个物种，illumina 的表达谱芯片因物种种类较少所以芯片升级比较快，目前已升级到 V4 版。Nimblegen 公司也有基因表达谱芯片，nimblegen 的表达谱芯片知名度、用户和文章是最少的，这也是 nimblegen 的基因表达谱芯片不被大家认可的原因，但是 nimblegen 的表达谱芯片也有自己的特点，在原核生物里，nimblegen 表达谱芯片的物种种类是最
8、丰富的。还有一点需要说明，nimblegen 每个物种的表达谱芯片都有 72K、135K 、385K 这 3 种规格，不同规格的芯片的效果和价格相差很大，所以大家在选用之前一点要搞清楚，千万别让奸商给忽悠了。总之，在基因表达谱芯片领域，因表达谱芯片采用的是直接杂交技术，技术门槛较低，所有的芯片制造商都可生产，各个厂家的芯片效果差别也不是很大，affymetrix 表达谱芯片的服务价格在 5000 左右；agilent 表达谱芯片的服务价格在 4500 左右；illumina表达谱芯片的服务价格在 3800 左右；nimblegen 表达谱芯片的服务价格在 2500-5000 之间；价格最贵并不
9、代表最好，价格最低也不代表最差，主要还是要看自己的实际情况，选择最适合自己实验研究的芯片。随着高通量测序技术被越来越多的用户所认可，表达谱测序技术（RNA-seq）取代表达谱芯片是大势所趋，因为表达谱芯片和 RNA-seq 想比较，除了价格便宜外，没有任何技术优势。毕竟 RNA-seq 的技术优势非常明显：更高的数据通量、更高的灵敏度和准确度、更丰富的生物信息学分析、不受数据库和物种的限制以及可获得mRNA 完整序列等等。在 DNA 甲基化芯片领域，主要分为两类，一类是基于 MeDIP 技术的甲基化芯片，如nimblegen 公司和 agilent 公司；另一类是基于 Bisulfite co
10、nversion 技术的单碱基分辨率的甲基化芯片，如 illumina 公司。在基于 Bisulfite conversion 技术的甲基化芯片出来之前，大家都使用的是 nimblegen 和 agilent 的甲基化芯片，虽然这种芯片效果很差，如：不能精确定量、无法提供单碱基分辨率、有区域偏向、假阴性和假阳性较高、需要高达 10ug 的DNA、价格高昂等。但因没有更好的选择，大家都只能用这类芯片。自从 2009 年 illumina推出了世界上首款基于 Bisulfite conversion 技术的全基因组甲基化芯片（ Human Methylation 27K BeadChip） ，才改
11、变了这一现状，Human Methylation 27K BeadChip 可检测人全基因组 2.7 万个甲基化位点，这是世界上第一款可提供单碱基分辨率，并可精确定量的甲基化芯片，当时表观遗传学领域引起了巨大反响，大量文章层出不穷。仅过了一年，2010 年 illumina 公司又推出了 27K 芯片的升级版Human Methylation 450K BeadChip，450K 芯片可检测人全基因组 48 万个甲基化位点，广泛应用于干细胞研究、肿瘤和其他疾病研究，是唯一一款适合 EWAS（表观基因组全关联分析）研究的全基因组DNA 甲基化芯片。每张芯片多达 900 万个点（9M） ，以极高的
12、密度覆盖了 99%的 RefSeq 基因和 96%的 CpG 岛，包括启动子区、5UTR 区、第一外显子区、gene body 区、3UTR 区、基因间区域以及 CpG 岛外低密度分布的 CpG 位点。此外该芯片还额外添加了一些高价值的信息，如：已经鉴定的在不同类型的肿瘤组织相对于其正常组织有差异的甲基化位点；人干细胞中已经鉴定的非 CpG 的甲基化位点（如 CpA，CpT） ；通过 GWAS 研究鉴定出的与疾病相关的区域；miRNA 基因的启动子区；编码区外的 CpG 岛；FANTOM 4 启动子区；DNase酶高敏感的位点；450K 全基因组甲基化芯片每个探针都有 15-25 倍重复，所以
13、芯片重复性高达 98%以上，和全基因组甲基化 Bisulfite 测序的相关性 R2=0.96，探针假阳性率低于1%。每个样本只需要 500ng 的基因组 DNA，适用于石蜡包埋组织和福尔马林保存样本。最重要的是，该芯片的成本是 nimblegen 2.1M 甲基化芯片的四分之一左右，市场服务价格不到 7000 元，芯片采用 12 个反应包装。另外 illumina 公司还可以提供任意 96 个位点和 384个位点的定制甲基化芯片，不受物种限制，适用于大样本量研究。自从 illumina 推出单碱基分辨率的甲基化芯片以来，nimblegen 公司和 agilent 公司的甲基化芯片因没有任何技
14、术优势以及成本高昂，渐渐退出了市场。同时要提醒一下，nimblegen 公司的甲基化芯片有385K、2.1M 等多种规格，价格相差数倍，大家选用之前一定要搽亮眼睛。另外，2012 年6 月 nimblegen 公司正式宣布退出基因芯片市场。microRNA 芯片领域目前主要有 agilent、Affymetrix 、illumina、丹麦 Exiqon、以及国产的联川生物，做的最好的当属 agilent 公司，agilent 公司的 microRNA 芯片不仅物种丰富，更新速度快，文章较多，并且 Agilent 公司开发的 miRNA 检测技术具有独特的探针设计，能特异性地检测出成熟的 miR
15、NA 并能很好地区分高度同源的 miRNA 分子。检测的动态范围可达到 4 个 log。Agilent 的 microRNA 芯片目前已更新到 18 版，芯片采用 860K 规格。排在第二名的要属丹麦 Exiqon 公司，该公司只做 microRNA 芯片的， Exiqon 的 microRNA 芯片目前已更新到 18 版，Exiqon 的 microRNA 芯片主要有两款，一款人，小鼠，大鼠芯片，该芯片覆盖 miRBase 数据库人，小鼠，大鼠三物种全部 microRNA 以及相关的所有病毒的microRNA；另一款是全物种芯片，该芯片覆盖的 miRBase 数据库内除人，大鼠，小鼠及其相关
16、病毒之外的全部物种（包括脊椎动物，无脊椎动物，植物，病毒等）的所有microRNA。Affymetrix 在 microRNA 芯片领域并不是很有名，但 Affymetrix 的特点是把几十个物种的所有 microRNA 全部集中到一张芯片上，也就是说 Affymetrix 只有一款 microRNA芯片，这款芯片可适用于几十个物种，这样做的目的可能是基于芯片生产成本的考虑，更方便芯片的更新，因为 microRNA 数据库每隔半年就会升级一次。但这样做可能会有人觉得有点浪费，尤其是近缘物种之间可能存在序列结构比较相近的 microRNA 无法精确分辨。联川生物在 microRNA 芯片领域也小
17、有名气，也是唯一一家国产的 microRNA 芯片，该芯片最大的特点就是更新速度极快，一般新的数据库发表后，第一个将芯片更新到最新版本的就是联川生物。illumina 公司于 2010 年退出了 microRNA 芯片市场，因 illumina 公司 2006年收购了高通量测序领域 NO.1 的 Solexa 公司，成为唯一一家即拥有芯片平台又拥有高通量测序平台的供应商，illumina 认为在 microRNA 领域，高通量测序有不可比拟的技术优势，必然会取代芯片，所以于 2010 年停产了 microRNA 芯片。随着高通量测序成本的不断下降，选择 microRNA 测序的人越来越多，毕竟
18、相对于microRNA 基因芯片来说， microRNA 测序有绝对的技术优势：更高的数据通量、更高的灵敏度和准确度、更宽的动态检测范围、可精确区分 miRNA 前体序列和成熟的 miRNA 以及高度同源的 miRNA 分子、更丰富的生物信息学分析以及不受数据库和物种的限制、并且可以检测到很多未知的 microRNA。目前随着大量新的 microRNA 不断的被发现，miRBase 数据库一般每隔半年就会升级一次，而芯片更新都会有一个大约 3-6 个月的滞后期，但microRNA 测序却不受此影响，可以随时使用最新版本的数据库来进行分析。目前从最新发表的文章来看，使用 microRNA 芯片的
19、文章在急剧较少，而用 microRNA 测序技术的文章却迅速大量涌现，目前做一个样本的 microRNA 测序的市场服务价格大概在 7000-8000 之间，做一个 microRNA 芯片的价格大概在 4000-5000 之间，因芯片的重复性较差，一般芯片要做3 个生物学重复，而 microRNA 测序一般做 2 个生物学重复，所以综合计算下来，microRNA测序和 microRNA 芯片的费用其实差不多。其实搞科研也要赶潮流，越是用最新的技术，越是能发好的文章，但课题的设计也非常的关键。目前 LncRNA（长链非编码 RNA）研究也十分的火热，很多科研工作者从 microRNA 研究转向到
20、了 LncRNA 研究。但 LncRNA 的研究工具十分的有限，主要有以下几种方法：使用Arraystar 公司的 LncRNA 芯片进行研究，大概覆盖 3 万多条数据库里已有的 LncRNA（人） ，目前康成生物可提供该项服务。还有可以利用 agilent 的 G3 版的全基因表达谱芯片来进行LncRNA 研究，可覆盖 7 千多条 LncRNA。还有上海 SBC 利用 agilent 定制表达谱芯片平台提供的 LncRNA 芯片服务，大约覆盖 3 万条 LncRNA。另外还有上海晶能生物采用 illumina 高通量测序平台成功开发的 LncRNA 测序服务，不仅可覆盖数据库里已有的所有 L
21、ncRNA，还可以覆盖大量未知的 LncRNA，总计可覆盖 7-8 万条 LncRNA，适合所有具有精细基因组图谱的物种。LncRNA 测序是目前 LncRNA 研究领域最先进、最时髦的技术，其效果远远好于LncRNA 芯片，但价格也不便宜，大约一个样本要 2.5 万左右。从投入产出比来考虑，其实LncRNA 测序更有优势，因为 LncRNA 是近一两年新兴的热门研究领域，目前还没有一个大家认可的权威的 LncRNA 芯片，所以用 LncRNA 芯片未必能发好的文章。总结：做 SNP 芯片：必选 illumina，affymetrix 就不要考虑了；做基因表达谱芯片：可选择 affymetrix、agilent 和 illumina，nimblegen 就不要考虑了；不在乎钱的就用 RNA-seq；做 microRNA 芯片：首选 agilent，其次 Exiqon，不在乎钱的就用 microRNA 测序；做甲基化芯片：必选 illumina，nimblegen 和 agilent 就不要考虑了；做 LncRNA 研究：直接上 LncRNA 测序，芯片就不要考虑了。
