1、1.原核生物DNA具有哪些不同于真核生物DNA的特征？真核生物：真核基因组庞大。存在大量的重复序列。大部分为非编码序列(90)。转录产物为单顺反子。是断裂基因，有内含子结构。存在大量的顺式作用元件(启动子、增强子、沉默子 )。存在大量的DNA多态性。具有端粒(telomere)结构原核生物：基因组很小，大多只有一条染色体，且DNA含量少。主要是单拷贝基因，只有很少数基因如rRNA基因 以多拷贝形式存在。整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列所组成；几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态1.试述基因克隆载体进化过程。pSC101质粒载体，第一个基因克隆载体ColE1质粒载体
2、，松弛型复制控制的多拷贝质粒pBR322质粒载体，具有较小的分子量（4363 bp）。能携带6-8 kb的外源DNA片段，操作较为便利pUC质粒载体，具有更小的分子量和更高的拷贝数pGEM-3Z质粒，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ 基因穿梭质粒载体，由人工构建的具有原核和真核两种不同复制起点和选择标记，可在不同的寄主细胞内存活和复制的质粒载体pBluescript噬菌粒载体，一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体2.试述PCR 扩增的原理和步骤。对比DNA体内复制的差异。原理：首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA 分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反
3、应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸、合适的Mg2+ 浓度和实验中提供的引物序列合成新生的DNA分子。步骤：将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（94 ）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形成单链模板DNA降低反应温度（退火，约50），约1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上将反应混合物的温度上升到72左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按53方向延伸，合成新生DNA 互补链与体内复制的差别：PCR不产生冈崎片段 在高温条件下反应，不需要DNA解旋酶PCR可经过多个循环在体外进行，可调控第六章
4、1.基因敲除原理：又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点方法：高等动物基因敲除技术，植物基因敲除技术2.完全基因敲除和条件型基因敲除完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动植物个体中的靶基因活性，条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除3.基因定点突变原理：通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等方法：
5、重叠延伸技术和大引物诱变法第七章1.乳糖操纵子的正负调控（）阻遏蛋白的负调控当细胞内有诱导物时，诱导物结合阻遏蛋白，此刻聚合酶与启动子形成开放式启动子复合物转录乳糖操纵子结构基因。当无诱导物时，阻遏蛋白结合与启动子与蛋白质部分重叠不转录。（=）CAP正调控当细胞内缺少葡萄糖时 ATPCAMP结合， CRP生成CAP与CAP 位点结合，增前RNA聚合酶转录活性。当有葡萄糖存在时CAMP分解多合成少，CAP不与启动子上的CAP 位点结合 RNA聚合酶不与操纵区结合无法起始转录结构基因表达下降2.色氨酸可阻遏、可诱导操纵子3.真核与原核生物基因转录有哪些差异？（1）只有一种RNA聚合酶参与所有类型的
6、原核生物基因转录，而真核生物有3种以上的RNA聚合酶来负责不同类型的基因转录，合成不同类型的、在细胞核内有不同定位的RNA（2）转录产物有差别。原核生物的初级转录产物大多数是编码序列，与蛋白质的氨基酸序列呈线性关系；而真核生物的初级转录产物很大，含有内含子序列，成熟的mRNA只占初级转录产物的一小部分（3）原核生物的初级转录产物几乎不需要剪接加工，就可直接作为成熟的mRNA进一步行使翻译模板的功能；真核生物转录产物需要经过剪接、修饰等转录后加工成熟过程才能成为成熟的mRNA（4）在原核生物细胞中，转录和翻译不仅发生在同一个细胞空间里，而且这两个过程几乎是同步进行的，蛋白质合成往往在mRNA刚开
7、始转录时就被引发了。真核生物mRNA的合成和蛋白质的合成则发生在不同的空间和时间范畴内7.蛋白质有哪些翻译后的加工修饰？其作用机制和生物学功能是什么？N端fMet或Met的切除细菌蛋白质氨基端的甲酰基能被脱甲酰化酶水解，不管是原核生物还是真核生物，N端的甲硫氨酸往往在多肽链合成完毕之前就被切除。二硫键的形成mRNA中没有胱氨酸的密码子，而不少蛋白质都含有二硫键，这是蛋白质合成后通过两个半胱氨酸的氧化作用生成的。二硫键的正确形成对稳定蛋白的天然构象具有重要的作用。特定氨基酸的修饰氨基酸侧链的修饰作用包括磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰化、泛素化、羟基化和羧基化等。切除新生肽链中的非功能片段由多个肽链
8、及其他辅助成分构成的蛋白质，在多肽链合成后还需经过多肽链之间以及多肽链与辅基之间的聚合过程，才能成为有活性的蛋白质简述大肠杆菌基因组和真核生物基因组的主要区别答：1、真核生物基因组指一个物种的单倍体染色体组(1n)所含有的一整套基因。还包括叶绿体、线粒体的基因组。 原核生物一般只有一个环状的 DNA分子，其上所含有的基因为一个基因组。2、原核生物的染色体分子量较小，基因组含有大量单一顺序（unique-sequences）， DNA仅有少量的重复顺序和基因。真核生物基因组存在大量的非编码序列。包括：.内含子和外显子、 .基因家族和假基因、重复DNA序列。真核生物的基因组的重复顺序不但大量，而且
9、存在复杂谱系。3、原核生物的细胞中除了主染色体以外，还含有各种质粒和转座因子。质粒常为双链环状DNA，可独立复制，有的既可以游离于细胞质中，也可以整合到染色体上。转座因子一般都是整合在基因组中。真核生物除了核染色体以外，还存在细胞器DNA，如线粒体和叶绿体的DNA，为双链环状，可自主复制。有的真核细胞中也存在质粒，如酵母和植物。4、原核生物的DNA 位于细胞的中央，称为类核（nucleoid）。真核生物有细胞核，DNA序列压缩为染色体存在于细胞核中。5、真核基因组都是由DNA 序列组成，原核基因组还有可能由RNA组成，如RNA 病毒。第七章1.简述代谢物对基因表达调控的两种方式。 答： 转录水
10、平上的调控； 转录水平上的调控 ，包括mRNA加工成熟水平上的调控和翻译水平上的调控3.简述乳糖操纵子的调控模型。 答：A、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含 Z、Y 、A 三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列 O，一个启动子 P 和一个调节基因I。 B、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I 基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列 O 处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。 C、C
11、AP 的正性调节：在启动子上游有 CAP 结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境 时，cAMP 浓度升高，与 CAP 结合，使 CAP 发生变构，CAP 结合于乳糖操纵子启动序列附近的 CAP 结合位点，激活 RNA 聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。D、协调调节：乳糖操纵子中的 I 基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP 的正调控两种机制，互相协调、互相制约。5.什么是弱化作用？ 答：1.当培养基中色氨酸的浓度很低时，负载有色氨酸的tRNATrp也就少，这样翻译通过两个相邻色氨酸密
12、码子的速度就会很慢，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp密码子处），这时的前导区结构是2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到将trp操纵子中的结构基因全部转录。 2.当培养基中色氨酸浓度较高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前就到达2区，使2-3区不能配对， 3-4区自由配对形成基一环终止子结构，转录被终止，trp操纵子被关闭。怎么去掉模板呢？再简单的方法就是用DpnI酶，DpnI 能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷
13、型的菌株），而PCR 产物都是没有甲基化的，所以DpnI 酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR 产物，从而去掉模板留下PCR 产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株，不会那么凑巧吧，哈哈。关于第三个问题：直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，呵呵，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序（这个就不用我多说了吧），验证突变结果，一般都没问题的啦，我做了几十个突变了，到目前为止还没有做不出来的，呵呵，不要砸我啊。要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达，通常遇到的问题有： (1)细菌的 RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子。 (2)大多数真核基因有内含子 ，这些
14、内含子在转录后从前体mRNA 中被切除而形成成熟mRNA。细菌细胞没有这样的机制来去除内含子。 (3)有些真核生物的蛋白质是通过前体分子加工而来的，例如胰岛素就是通过加工去除 前体分子内部的33个氨基酸残基而来，剩下的两段肽链分别形成 胰岛素的a 、b链。 (4)产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的 蛋白酶所识别和降解。 针对上述可能出现的问题，建议在克隆的过程中采取以下措施： 应将激素的编码序列置于含有核糖体结合位点和起始密码子ATG 的细菌强启动子的附近(含有这种序列的载体称表达载体 )。 可以以激素的mRNA为模板用 反转录酶合成激素的基因。这种DNA 不含内含子可插入到载体中进行克隆
15、。此外，如果蛋白质序列短则可通过化学合成得到该基因。合成的基因应含起始密码ATG、通过该激素蛋白的氨基酸序列推测而来的 编码序列，以及12 个终止密码： ATG编码序列TGA TAG 现在，这个合成基因可被插入载体中。 有时加工过程可以在离体条件下进行。如果加工有困难，可以用合成基因，从而免除加工过程。 选用合适的突变型宿主从而防止蛋白酶水解。如果用酵母作为宿主上述许多问题都可以较容易地解决，尤其是现在有既能在大肠杆菌中又能在酵母中复制的穿梭质粒载体。 说明：1)ATG,TAG和TGA是对应mRNA中的转录起始信号AUG和终止信号UAG,UGA的DNA序列。 2)克隆生长素释放抑制因子基因时采用化学合成基因的方法。生长索释放抑制因子是一种由下丘脑分泌的激素，长14个氨基酸残基，因此人工合成的基因，包括在 宿主菌中表达所需的转录的起始和终止信号，仅51bp长。
