1、第 37卷 分析化学 ( FENX I HUAXUE) 研究报告 第 7期 2009年 7月 ChineseJournalofAnalyticalChemistry950954 研究报告规模化蛋白质生物质谱鉴定中肽段氨基端环化修饰现象卢庄 1, 2 赵丽艳 2 张养军 2 蔡耘 21(北京理工大学生命科学与技术学院,北京 100081)2 (蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,北京放射医学研究所,北京 102206)_C)残基起始的肽段会发生氨基端的环化修饰,且修饰反应不完全,在同一样本中修饰与非修饰两种状态常同时存在,并且环化修饰后的肽段摘 要 对蛋白质样品制备中引入的氨基酸残基
2、的一种现象初步研究结果显示,很多以谷氨酰胺(Q)或氨乙酰化修饰的半胱氨酸(CAM 邓玉林 1 张玉奎 1 钱小红 3 1, 2 蛋白质酶切肽段氨基端的环化修饰现象的的反相色谱保留时间发生延迟。在数据库检索时添加环化修饰 ,可以提高蛋白质的鉴定成功率。本研究结果为大规模的蛋白质质谱数据解析提供了有价值的参考。关键词 肽段氨基端 ,环化 ,规模化 ,蛋白质鉴定1 引 言细胞或组织内存在的全部蛋白质的定性和定量分析是蛋白质组学研究的主要内容 1。为了从细胞中鉴定目标蛋白质 ,候选蛋白质常用串联质谱 (MS/MS)法 2, 3结合生物信息学的数据库检索进行分析。样品中的蛋白质通常先被胰蛋白酶消化成较小
3、的肽段 ,然后经反相色谱分离进入质谱 ;肽段经离子化、碎裂后 ,产生用于鉴定的特征的 MS/MS数据 ;通过在理论序列数据库中搜索 MS/MS谱图来寻找最佳匹配的肽段 ,从而鉴定样本蛋白质。然而 ,在实际的蛋白质鉴定中 ,通常只有或少于 10%的 MS/MS谱图能够有效地鉴定出蛋白质 ,而大量的图谱都不能被解析 4。 MS/MS数据没有得到可靠的鉴定结果 ,除了谱图质量差 ,还有一个原因就是匹配不好。很多碎片信息很丰富的 MS/MS谱图在检索时的得分也很低 ,其原因是可能此肽段在数据库中不存在、或某些蛋白质本身存在 ,但人工处理过程中引入的各种氨基酸残基的多种修饰影响其鉴定。蛋白质修饰的多样性
4、和不均一性造成检索时实验值与理论值不相匹配 ,进而影响其质谱数据的正确解析。目前 ,肽段鉴定时常用的添加残基修饰有甲硫氨酸 (Met)的氧化和半胱氨酸 (Cys)的氨乙酰化 ,而对其它修饰研究很少。文献报道 ,以谷氨酰胺 (Q)、谷氨酸 ( E)或氨乙酰化修饰的半胱氨酸 (CAM _C)残基起始的肽段 ,在样品处理 10 或者自发 11 等状况下都会发生氨基端的环化修饰。这些发生了环化修饰的肽段由于质量数的偏移 ,在数据库检索时经常不能被正确鉴定。为了给蛋白质的鉴定分析提供更准确、完整的信息 ,得到更可靠的鉴定结果 ,本实验对蛋白质酶切肽段的端肽环化修饰现象进行了初步研究。 2 实验部分 2.
5、 1 仪器与试剂毛细管高效液相色谱 2电喷雾 2线性离子阱质谱仪 (CapLC2ESI2LTQ 2MS, Thermo Finnigan公司 );安捷伦 1100毛细管色谱系统 ,包括自动上样器 ,上样泵 (含十通阀 )和二元洗脱泵 (Agillent公司 ) ; 4800 Pro2 teom ics Analyzer基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪 (MALD I2TOF2TOF MS,美国 AB I公司 );电热恒温水浴箱 (北京医疗设备厂 ) ;BP211d分析天平 (瑞士 Sartorius公司 )。2008208229 收稿 ; 2008212218接受本文系国家自然科学基金
6、(Nos. 20635010, 20505018, 20735005)和国家重点基础研究计划 (No. 2007CB914104)资助项目 E2mail: qianxhnic. bmi. ac. cn . 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/第 7期卢庄等 :规模化蛋白质生物质谱鉴定中肽段氨基端环化修饰现象 所有标准蛋白均购自 Sigma公司 ;碘乙酰氨 ( IAA )和甲酸 ( FA )购自比利时 ACROS公司 ;乙腈 (HPLC级 ,美国 J. T
7、. Baker公司 );胰蛋白酶 ( Tryp sin,测序级 )和二硫苏糖醇 (DTT)购自美国 Promega公司 ; 0. 45m 滤膜有机相微孔过滤膜 (天津津腾公司 );超纯水由 M illipore2Q A10型纯水系统 (美国 M il2 lipore公司 )制备 ,其它试剂均为国产分析纯。 2. 2 实验方法 2. 2. 1 蛋白质样品的处理 按照目前蛋白质组研究中经典的蛋白质变性、还原、烷基化的处理步骤处IAA溶液在室温下置于暗处反应 1h。然后稀释样品至其中尿素浓度500 Da、并以 Q /E/CAM _C残基起始的肽段分别有 3、5 . 1994-2009 China A
8、cademic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/分析化学 第 37卷和 4个。质谱分析的结果显示 ,这 12个肽段中的 8个都发生了肽段氨基端环化修饰 ,鉴定结果如表 2。其中 ,原型检索设置的修饰为固定修饰 :半胱氨酸的氨乙酰化 ;草药可变修饰 :甲硫氨酸氧化。环化检索设置的修饰为固定修饰 :半胱氨酸的氨乙酰化 ;可变修饰 :甲硫氨酸氧化和氨基末端 Q /E/CAM _C的环化。表 2 BSA 中发生环化修饰的肽段 Table 2 Terminal cyclized peptides from B
9、SA序号 肽段序列 肽段理论质量数 保留时间 肽段最高分 检到次数 No.Sequence Theoretic massRPLCRetention timeScoreTimes of detection 15.15 14 3 5 1 K. QTALVELLK. H原型 原型 Initial form : 1067. 4342 14. 19 环化 Cyclization form: 1050. 4077 15. 83 原型 Initial form: 1672. 7627 16. 45 环化 Cyclization form: 1655. 7362 17. 92 原型 Initial form:
10、 705. 3479 13. 92 Initial form: 1013. 6121 23. 38 42 19 39 35 7环化 Cyclization form: 996. 5855 25. 77 16.84 56 9环化 Cyclization form: 1120. 4641 18. 37 31 3 6 环化 Cyclization form: 688. 3214 K. CCTESLVNR. R原型 Initial form: 1137. 4907 R. CCTKPESER. M原型 Initial form: 1165. 4856 12. 80 27 1环化 Cyclization
11、form: 1148. 4590 14. 77 49 6 4 2 K. QNCDQFEK. L44 3 K. QEPERNECFLSHK. D25 445 1 4 R. CASIQK. F427 K. CCAADDKEACFAVEGPK. L原型 Initial form: 1926. 7910 18. 23 77 3环化 Cyclization form: 1909. 7644 19. 77 90 4 K. CCAADDKEACFAVEGPKLV2 原型 Initial form: - -8 VSTQTALA. 2环化 Cyclization form: 2893. 3296 18. 58
12、13 1 9 K. ECCDKPLLEK. S原型 Initial form: 1290. 5948 15. 90 33 4环化 Cyclization form: 1272. 5842 17. 57 25 1添加环化修饰为可变修饰 ,对数据进行数据库检索 ,比添加修饰前多解析了 27个二级质谱图 ,共找到 10条肽段发生了环化修饰。一些 MS/MS图谱得到很好的匹配 ,其中 7条环化修饰后的肽段最高得分都超过了原型肽段 ,蛋白质的得分也由 8593提高到 9403。而且 ,反应常是不完全的 ,出现环化肽段和原型肽段并存于样本中的现象 (如图 1) ,并且由于氨基端的成环 ,使肽段的疏水性增加
13、 ,在反相色谱上的保留行为发生了改变 ,保留时间普遍延迟 (见表 2)。图 1 环化肽段和原型肽段共存的 MALD I2TOF MS一级质谱图 Fig. 1 MALD I2TOFMS spectrum of peptides and its cyclization form 3. 2 10 种标准蛋白质混合物的环化修饰现象不考虑漏切位点时 , 10种标准蛋白质的胰酶酶切肽段中 500 Da、并以 Q /E/CAM _C残基起始的肽段分别有 7、19 和 10个 ,质谱鉴定到的发生环化的肽段数目分别是 3、2 和 6个 ,具体的肽段如表 3所示。综上发现 ,肽段氨基末端以谷酰胺 (Q )和氨乙酰
14、化修饰的半胱氨酸 (CAM _C)起始时 , 40%以上的肽段都可能发生氨基末端残基的环化修饰 ,统计结果如图 2所示。有研究表明 ,起始残基为 Q的肽段氨基端会发生脱氨基的环化修饰反应 6 ,形成 22吡咯烷酮 252羧酸残基 ;起始残基为 E的肽段氨基端会发生脱水的环化修饰反应 7 ,形成焦谷氨酸残基。而经过氨乙 . 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/第 7期卢庄等 :规模化蛋白质生物质谱鉴定中肽段氨基端环化修饰现象 酰化修饰的半胱氨酸 C8, 9
15、 ,在化学结构上与 Q残基相似 ,也发生了脱氨基的环化修饰 ,形成了 52氧硫吗啉 232羧酸残基 (各反应原理如图 3所示 ),这与本实验结果相吻合。表 3 10 种标准蛋白质酶切肽段混合物的环化修饰 Table 3 Terminal cyclization of peptides from ten standard proteins编号 名称 Q/E/ CAM _C起始的肽段数目 检测到的环化肽段及最高得分 Numberof peptideswith No.Protein name Cyclized peptides and score N 2terminal residuesQ/E/CA
16、M _C1 乳清蛋白 2Lactalbumin 0 2 1 -(R. EDLIAYLK.(K. CEVFRELK. D)6 2 22 酪蛋白 2Casein 030 3肌红蛋白 Myoglobin 0 1 0 4细胞色素 C Cytochrome C 0 1 1 0 1 0 0 3 0 K) 4 (R. CELAAAMK. R) 33 5溶菌酶 Lysozyme 0 (R. CELAAAMKR. H) 56 6 核糖核酸酶 A Ribonuclease A 人白蛋白 Human albumin 2 乳球蛋白 2Lactoglobulin 0 -7卵清白蛋白 Ovalbumin 0 -81 2
17、1 (R. QHMDSSTSAASSSNYCNQMMK. S) 107 (K. CCKADDKE) 8 (K. QTALVELVKH) 46 9.(.) 3 5 4 (K. CCTESLVNR. R)16 (K. CCAAADPHECYAK. V) 3 (K. EQLKAVMDDFAAFVEK. C) 8 (K. QDGQFSVLFTK. C) 15 10胎球蛋白 Fetuin 3 2 2 (K. CNLLAEK. Q)13Q: glutamine; E: glutamic acid; CAM _C: caramoylmethylcysteine.图 2 末端 Q/E/CAM _C残基发生环化
18、修饰的肽段比例 Fig. 2 Proportion of cyclized peptideswith N 2terminal res2 idues ofQ/E/CAM _CGarden等 10 认为 ,肽段氨基末端发生的环化修饰是在样品制备 (酶切 )、HPLC 分离或随后的质谱离子化 ( ESI或 MALD I)过程中产生的一种人工产 图 3 谷酰胺 ( a)、谷氨酸 (b)、烷基化半胱氨酸 ( c)的物。但是 ,文献 11 报道了某些蛋白质和多肽的氨环化反应原理 基端 Q残基也可经历自发环化形成吡咯型谷氨酸 ,Fig. 3 Principle of cyclization of gluta
19、mine (a) /glutamic 并且这种环化修饰与蛋白质或多肽的生物活性相 acid (b) /carbozyamidomethyl2Cys (c) residues关 12 。而 Huang等 13 发现 ,环化修饰也可是一种酶促反应 (谷氨酰基环化酶等 )。 4 结 论在进行质谱数据检索时添加上 Q /E/CAM _C的环化修饰 ,可给蛋白质的鉴定分析提供更准确、完整的信息。但许多肽段的环化修饰是不完全的 ,在同一样本中修饰与非修饰两种状态常同时存在 ,并且环化后的肽段在反相色谱上的保留时间会延迟 ,结合此类色谱和质谱的信息 ,可以帮助得到更可靠的蛋白质鉴定结果。肽段环化的程度可能受
20、操作条件的影响 ,并可能与蛋白质的序列有关。如文献 14 报道 ,免疫球蛋 . 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/分析化学第 37卷白 抗体中氨基端谷氨酸的环化在 pH 6. 2环境下进行缓慢 ,而在溶液 pH 4和 pH 8时形成较快 ; Khandke等 15 用链状球菌 PepM49蛋白酶切肽段研究发现 ,与 NH4 HCO3缓冲体系相比 ,谷酰胺残基起始的肽段在磷酸盐缓冲液中氨基端环化会加速。有关氨基端残基的环化修饰更详细的信息还需要更深入的研
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