1、淀粉酶的制备与活力测定 基础知识淀粉酶是水解淀粉（包括糖原、糊精）中糖苷键的一类酶的统称，广泛存在于动植物和微生物中。它是研究较多、生产最早、产量最大和应用最广的一类酶。1.-淀粉酶的结构目前，已对很多不同种类和来源的 -淀粉酶（黑曲霉、米根霉、人和猪胰腺、人唾液腺、大麦种子和地衣芽孢杆菌)的晶体结构进行了 X-射线衍射研究，并得到了高分辨率的晶体结构图。研究表明所有 -淀粉酶均为分子量在50ku 左右的单体，由经典的三个区域(A、B、C)组成：中心区域 A 由一个(/) 8圆筒构成；区域 B 由一个小的 -折叠突出于 3和 3之间构成；而C-末端球型区域 C 则由一个 Greek-key 基
2、序组成，为该酶的活性部位，负责正确识别底物并与之结合。为保持 -淀粉酶的结构完整性和活性，至少需要一个能与之紧密结合的 Ca2+，而 Cl-往往是 -淀粉酶的变构激活因子，并且在所有 Cl-依赖性的 -淀粉酶中，组成催化三联体的残基都是严格保守的 10。2.-淀粉酶的性质早在 1967 年，Jones 和 Varner 就对小麦中 -淀粉酶的活性进行了研究11。不同来源的 -淀粉酶的酶学和理化性质有一定的区别，它们的性质对在其工业应用中的应用影响也较大，在工业生产中要根据需要使用合适来源的酶，因此对淀粉酶性质的研究也显得比较重要。 2.1底物特异性 -淀粉酶和其它酶类一样，具有反应底物特异性，
3、不同来源的淀粉酶反应底物也各不相同，通常 -淀粉酶显示出对淀粉及其衍生物有最高的特异性，这些淀粉及衍生物包括支链淀粉、直链淀粉、环糊精、糖原质和麦芽三糖等。2.2最适 pH 和最适温度 反应温度和 pH 对酶活力影响较大，不同来源的 -淀粉酶有各自的最适作用 pH 和最适作用温度，通常在最适作用 pH 和最适作用温度条件下酶相对比较稳定，在此条件下进行反应能最大程度地发挥酶活力，提高酶反应效率。因此，在工业应用中应了解不同的酶最适 pH 和最适温度，确定反应的最佳条件，最大限度地提高酶的使用效率是很重要的。 通常情况下 -淀粉酶的最适作用 pH 一般在 2 到 12 之间变化。真菌和细菌类 -
4、淀粉酶的最适 pH 在酸性和中性范围内，如芽孢杆菌 -淀粉酶的最适pH 为 3，碱性 -淀粉酶的最适 pH 在 912。另外，温度和钙离子对一些 -淀粉酶的最适 pH 有一定的影响，会改变其最适作用范围。不同微生物来源的仅一淀粉酶的最适作用温度存在着较大差异，其中最适作用温度最低的只有2530，而最高的能达到 100130。另外，钙离子和钠离子对一些酶的最适作用温度也有一定的影响 12。2.3金属离子 -淀粉酶是金属酶，很多金属离子，特别是重金属离子对其有抑制作用；另外，巯基，N-溴琥珀酸亚胺，p-羟基汞苯甲酸，碘乙酸，BSA，EDTA 和 EGTA等 对 仅一淀粉酶也有抑制作用。 -淀粉酶中
5、至少包含一个 Ca2+，Ca 2+使酶分子保持适当的构象，从而维持其最大的活性和稳定性。Ca 2+对仅一淀粉酶的亲和能力比其它离子强，其结合钙的数量在 1 到 10 之间。结晶高峰淀粉酶 A(TAA)包含 10 个 Ca2+，但只有一个结合很牢固。通常情况下结合一个 Ca2+就足以使 -淀粉酶很稳定。用 EDTA 透析或者用电渗析可以将 Ca2+从淀粉酶中除去，加入 Ca2+可以激活钙游离酶。用Sr2+和 Mg2+代替 TAA 中的 Ca2+，在 Sr2+和 Mg2+过量的情况下也能使其结晶。加入Sr2+、Mg 2+和 Ba2+离子可以激活用 EDTA 失活的 TAA。通常情况下，有 Ca2+
6、存在淀粉酶的稳定性比没有时要好，但也有报道 -淀粉酶在 Ca2+存在时会失活，而经 EDTA 处理后却保留活性，另外，有报道称 Ca2+对仅一淀粉酶没有影响。2.4电场强度实验结果表明，不同强度电场导致酶活性增加的效应不同，并且呈非单调性变化。我们认为，不同强度电场对酶蛋白分子的构象产生了不同影响，处理酶所用的电场能量虽然不足以改变酶蛋白氨基酸序列，但可以改变酶蛋白的构象姚占全等 13用不同强度电场处理 -淀粉酶 5min，处理后分别在第 1 天与第 1O 天测定电场对 -淀粉酶活性的影响。第 1 天测定结果表明，电场对酶产生明显影响，而且不同强度电场对 -淀粉酶活性的影响程度不同，在0.56
7、.0kVcm 范围内，酶活性随场强增加呈非单调性变化，与对照组相比，变化幅度在 5.5%26.2%之间。第 1O 天测定，酶活性变化幅度在 0.216.3%之间，表明电场对酶产生的影响经过一定时间后趋于消失。3.-淀粉酶的工业应用 -淀粉酶是淀粉及以淀粉为材料的工业生产中最重要的一种水解酶，其最早的商业化应用在 1984 年，作为治疗消化紊乱的药物辅助剂。现在，-淀粉酶已广泛应用于食品、清洁剂、啤酒酿造、酒精工业、纺织退浆和造纸工业。3.1在焙烤工业中的应用 各种酶制剂在食品工业中的应用已有上百年的历史，最近几十年 -淀粉酶广泛地应用于焙烤工业中焙烤工业中使用的酶制剂有很多，如蛋白酶、脂肪酶、
8、普鲁兰酶、木聚糖酶、纤维素酶、糖化酶等，但没有一种酶能取代 -淀粉酶在焙烤食品中的应用。-淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大，纹理疏松；提高面团的发酵速度；改善面包心的组织结构，增加内部组织的柔软度；产生良好而稳定的面包外表色泽；提高入炉的急胀性；抗老化，改善面包心的弹性和口感；延长面包心储存过程中的保鲜期。 面包等焙烤食品储存一定时间后逐渐变干变硬，易碎，风味变差，这些都是由于面包的陈化造成的，每年由于面包老化造成巨大的损失。传统的用于抑制老化，提高焙烤食品质地和风味的添加剂主要有化学试剂，食糖，奶粉，糖酯，卵磷脂和抗氧化剂等，近几年，酶 制剂越来越多的作为面团改良剂和抗老化剂用在焙烤工
9、业中，包括 -淀粉酶、分支酶、去分支酶、-淀粉酶和普鲁兰酶等，其中将 -淀粉酶和普鲁兰酶联合使用可以有效的延迟焙烤食品陈化，提高产品的货价期。但是 ，在使用 -淀粉酶时，对其加入量要求比较严格，稍微过量就会导致面包等焙烤食品粘度的增加。因此，最近人们逐渐使用中温-淀粉酶，由于其最适作用温度在 5070左右，所以其在淀粉糊化时具有活性，而在焙烤过程中则会逐渐失活，最终在焙烤完成时活性丧失。而且，在加工过程中 -淀粉酶会水解淀粉生成聚合度在 49 的糊精，这些糊精也具有抗老化性。但是，现在中温 -淀粉酶仅能从极少的一些微生物中提取 14，15 。3.2在淀粉工业中的应用 -淀粉酶用于淀粉工业，可用
10、来生产变性淀粉、淀粉糖等。由于 -淀粉酶在适宜条件下对淀粉具有较强的水解能力，控制反应的条件，可以控制淀粉的水解率，从而将淀粉水解成多孔状的多孔淀粉。多孔淀粉可以作为微胶囊芯材和吸附剂，作为香精香料、风味物质、色素、药剂及保健食品中功能成分的吸附载体，成本低，可自然降解，现已广泛应用于食品、医药、化工、农业、保健品等领域。淀粉在高温条件下发生糊化，因此生产多孔淀粉多采用中温-淀粉酶，另外，将 -淀粉酶和其它淀粉酶如糖化酶、普鲁兰酶等协同使用会提高反应效率和淀粉成孔效果，因此现在多孔淀粉的研制多采用 -淀粉酶和其它酶协同反应。 -淀粉酶现已广泛的应用于淀粉糖的生产，主要用于淀粉的糖化和液化，因此
11、都采用高温酶。工业生产中，淀粉的液化是将 -淀粉酶先混入淀粉乳中，加热，淀粉糊化后进行液化。由于 -淀粉酶对于糊化淀粉具有很强的催化水解作用，因此可以迅速将淀粉水解成 小分子，使其粘度降低，流动性增高，以利于淀粉的糖化 16。3.3在啤酒酿造中的应用 啤洒是最早用酶的酿造产品之一，在啤洒酿造中添加 -淀粉酶使其较快液化以取代一部分麦芽，使辅料增加，成本降低，特别在麦芽糖化力低，辅助原料使用比例较大的场合，使用 -淀粉酶和 -淀粉酶协同麦芽糖化，可以弥补麦芽酶系不足，增加可发酵糖含量，提高麦汁率 ，麦汁色泽降低，过滤速度加快，提高了浸出物得率，同时又缩短了整体糊化时间。啤洒酿造中糊化时添加 -淀
12、粉酶，在 20 世纪 70 年代主要用 BF7658-淀粉酶；80 年代用食品级枯草杆菌 -淀粉酶；80 年代末，我国无锡酶制剂厂首先生产出耐高温 -淀粉酶，可使副原料比例从原来的 30增加到 40以上，实现了无麦芽糊化，节粮、节能显著，使啤酒行业的综合经济效益得到进一步提高 17。 3.4在酒精工业中的应用 在玉米为原料生产酒精中添加 -淀粉酶低温蒸煮的新工艺，每生产1t 酒精可节煤 224.42kg。又可减少冷却用水，提高出酒率 8.8，酒精成品质量也有显著提高。酒精生产应用耐高温 -淀粉酶。采用中温 95105蒸煮，既可有效地杀死原料中带来的杂菌，降低入池酸度和染菌机率，又可保护原材料中
13、的淀粉组织不被破坏，形成焦糖或其它物质而损失，从而提高原料利用率18。3.5在纺织退浆中的应用 由于棉织物在编织过程中需使用较大的张力，容易使丝线断裂，因此需加入一些浆料对其保护。织物退浆主要使用 -淀粉酶，它会使淀粉大分子发生分解，生成可溶性的水解产物，减弱了对纤维的粘附力。早期是用麦芽产生的一种内生酶来退浆，近期则使用真菌或细菌淀粉酶。细菌淀粉酶尤其适用，因为它们能够耐高温，在碱性的环境里有一定的稳定性，具有一个中性的最适 pH值(pH57.5)。酶的催化效率高，有利于提高生产效率。如用碱分解淀粉退浆需要 l0h12h，而用 -淀粉酶只要 20min30min 即可完成退浆过程。淀粉酶退浆
14、的另一原因是比其它退浆剂(如酸或氧化剂)更利于环保。在退浆浴中添加钙盐，可提高淀粉酶的稳定性，从而可用较高的温度或较低的酶剂量来达到退浆的目的 19。3.6在造纸中的应用 当代造纸工业中，造纸用化学品在提高纸品质量、增加纸品功能、提高生产效率和降低生产成本等方面发挥着极为重要的作用。由于淀粉与造纸用植物纤维素结构相近，相互间有 良好的亲和作用，资源广泛，廉价易得，尤其是经变性处理的淀粉，能赋予纸张优异的性能，因此各类变性淀粉在造纸中广泛用于湿部添加、层间喷雾、表面施胶和涂布粘合。-淀粉酶可以生产涂布粘合用变性淀粉。 3.7在清洁剂中的应用 目前，各种酶制剂广泛地应用于现代高密度清洁剂。酶用在清
15、洁剂中最主要的优点是它的反应条件比无酶清洁剂温和，早期的洗碟机用洗涤剂反应需要的条件比较苛刻，使用时容易对餐具造成损伤，而且它不能用于清洗精巧瓷器和木质餐具，因此清洁剂工业开始寻找条件温和，更加有效的清洁剂，而将酶制剂用于清洁剂以后，可以在较低的清洗温度下就到达很好的清洗效果。现在，几乎 90以上的液体清洁剂中都含有 -淀粉酶,而且其在洗碟机用洗涤剂中的应用需求还在不断的增加。 4.展望 综上所述，各种 -淀粉酶作为一种重要的工业用酶，已经广泛应用于淀粉及淀粉基工业中，且已经取得了很好的使用效果。对缩短生产周期，提高产品得率和原料的利用率，提高产品质量和节约粮食资源，都有着极其重要的作用。但由
16、于不同来源 -淀粉酶的性质上 的差异，导致了其应用受到一定的局限，如耐高温 -淀粉酶在高温条件下才能发挥最大活力，在低温和中温时其利用效率很低，从而限制了其应用范围。另外，不同 -淀粉酶应用于食品中，其安全性有的尚未完全肯定。因此，在以后的研究中，可以通过化学方法或生物方法对 -淀粉酶进行改性，扩展其使用的范围，提高使用效率。无论如何，随着科技的发展、研究的深入，-淀粉酶将会得到更加广泛的应用。一、实训目的学习和掌握测定淀粉酶（包括 -淀粉酶和 -淀粉酶）活力的原理和方法。二、实训原理淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等
17、小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括 -淀粉 -淀粉酶两种。- 淀粉酶可随机地作用于淀粉中的 -1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使 3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的 3-氨基 -5-硝基水杨酸，其反应如下：淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于几乎所有植物中，特
18、别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是 -淀粉酶和 -淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，-淀粉酶不耐酸，在 pH3.6 以下迅速钝化。-糖酸淀粉酶不耐热，在 7015min 钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化 -淀粉酶，测出 -淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（-淀粉酶活力+-淀粉酶活力），再减去 -淀粉酶的活力，就可求出 -淀粉酶的活力。三、实训材料、主要仪器和试剂1实验材料 萌发的小麦种子（芽长约 1cm）2仪器（1 ）离心机 （2）离心管 （3）研钵（4）电炉 （5）容量 50mL1, 100mL1
19、（6）恒温水浴（7）20mL 具塞刻度试管13（8 ）试管架（9）刻度吸管 2mL3, 1mL2, 10mL1 （10）分光光度计3试剂（均为分析纯） （1）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取 100mg 麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至 100mL。（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取 3,5-二硝基水杨酸 1g，溶于 20mL 2mol/L NaOH 溶液中，加入 50mL 蒸馏水，再加入30g 酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至 100mL。盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入。若溶液混浊可过滤后使用。（3）0.1mol/L pH5.6 的柠檬酸缓冲液A 液：（0.1mol/L 柠檬酸）：称
20、取 C6H8O7H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至 1L。B 液：（0.1mol/L 柠檬酸钠）：称取 Na3C6H5O72H2O29.41g，用蒸馏水溶解并定容至 1L。取 A 液 55mL 与 B 液 145mL 混匀，即为 0.1mol/LpH5.6 的柠檬酸缓冲液。（4）1%淀粉溶液： 称取 1g 淀粉溶于 100mL 0.1mol/L pH5.6 的柠檬酸缓冲液中。 四、操作步骤1、麦芽糖标注曲线的制作取 7 支干净的具塞刻度试管，编号，按表 1 加入试剂：试剂管号1 2 3 4 5 6 7麦芽糖标准液（mL）0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0蒸馏水（mL）2
21、.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 0麦芽糖含量（mg）0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.03,5-二硝基水杨酸（mL）2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0摇匀，置沸水浴中煮沸 5min。取出后流水冷却，加馏水定容至20mL。以 1 号管作为空白调零点，在 520nm 波长下比色测定吸光度值。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。 2、淀粉酶液的制备称取 1g 萌发 3 天的小麦种子（芽长约 1cm） ，置于研钵中，加入少量石英砂和 2mL 蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用 6mL 蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提
22、取 1520min，每隔数分钟搅动 1 次，使其充分提取。然后在 3 000r/min 转速下离心 10min，将上清液倒入 100mL 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于-淀粉酶活力测定。吸取上述淀粉酶原液 10mL，放入 50mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。 3.酶活力的测定： 取 6 支干净的试管，编号，按表 2 酶活力测定取样表进行操作。 酶活力测定取样表 -淀粉酶活力测定操作项目1 2 3淀粉酶原液（mL） 1.0 1.0 1.0钝化 -淀粉酶 置 70水浴 15min，冷却淀粉酶稀释（mL） 0 0 03,5
23、二硝基水杨酸（mL）2.0 0 0预保温 将各试管和淀粉溶液置于 40恒温水浴中保温 10min1%淀粉溶液（mL） 1.0 1.0 1.0保温 在 40恒温水浴中准确保温 5min3,5二硝基水杨酸（mL）0 2.0 2.0 取三支试管。 于试管中加入酶液 1ml，在 700.5恒温水浴中确切加热 15min，钝化 淀粉酶。取出后迅速用流水冷却。 在对照管中加入 4ml 0.4mol/L 氢氧化钠。 在 4 支试管中加入 pH5.6 柠檬酸钠缓冲液。 将 4 支试管置于恒温水浴中，在 40 0.5保温15min，再向各个试管中加入 40下预热的 1%淀粉液2ml，摇匀，立即放入 40恒温水浴
24、 5min，取出后 向测定管中加入 4ml 0.4mol/L 氢氧化钠，终止酶活动，准备测酶。4.淀粉酶总活力测定取酶液 5ml，用蒸馏水稀释至 1000ml，为稀释酶液。另取 4 支试管编号，2 支为对照，2 支为测定管。然后加入稀释酶液 1ml。在对照管中加入 4ml 0.4mol/L 氢氧化钠。4 支试管中加入 1mlpH5.6 柠檬酸钠缓冲液。以下步骤重复 -淀粉酶活力测定步的操作，同样准备测糖。五、结果计算计算- 2、- 3 光密度平均值与- 1 光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg） ，按下列公式计算 - 淀粉酶的活力。淀粉酶活力=CV T/（WV ST）式中，C 为
25、从标准曲线上差得的麦芽糖含量，mg；V T 为淀粉酶原液总体积，mL；V S 为反应所用淀粉酶原液体积， mL；W 为样品质量，g；T 为反应时间，min。六、备注（1）样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。 （2）为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达 5min 时取出试管，立即加入 3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。同时恒温水浴温度变化应不超过0.5。 （3）如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌发1d、2d、3d、4d 的小麦种子，比
26、较测定结果，以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。 七、思考题1为什么要将- 1、- 2、- 3 号试管中的淀粉酶原液置70水浴中保温 15min？回答：由于 -淀粉酶不耐热，7015min 被钝化，所以将此 3个试管中的溶液在 70保温 15min 使其钝化，从而测得的淀粉酶活性即为 -淀粉酶活性。2为什么要将各试管中的淀粉酶原液和 1%淀粉溶液分别置于40水浴中保温？回答：酶反应需要适当的温度，只有在一定的温度条件下才表现出最大活性，40是淀粉酶的最适温度，所以应将酶液和底物（淀粉液）先分别保温至最适温度， 然后再进行酶反应，这样才能使测得的数据更加准确。八、参考文献：1 钱海丰，赵晓娟
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