1、T、B 淋巴细胞分离试验2006-12-28 00:00:00 来源： 评论：0 我要评论淋巴细胞主要分 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞两大亚群，它们具有不同的特性和功能，为此在进行某些免疫学实验时，首先需分离出纯的 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞。本试验的原理为：淋巴细胞与用溴花二氨基异硫氢化物（简称 AET）处理的绵羊红细胞（SRBC）混合后，其中全部 T 淋巴细胞均能吸附 AETSRBC PCR 实验交流 核酸实验交流 细胞实验交流 蛋白实验交流 免疫实验交流 生物软件交流淋巴细胞主要分 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞两大亚群，它们具有不同的特性和功能，为此在进行某些免疫学实验时，首先需分离出
2、纯的 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞。本试验的原理为：淋巴细胞与用溴花二氨基异硫氢化物（简称 AET）处理的绵羊红细胞（SRBC）混合后，其中全部 T 淋巴细胞均能吸附 AETSRBC，形成牢固稳定而巨大的 E花环，较正常未处理的 SRBC 形成的 E花环百分比为高，而且形成快速，不易脱落，重复性好。再经淋巴细胞分层液分离时，AETE 花环易沉于管底，而未形成 E花环的 T 淋巴细胞，用低渗液解花环周围的 AETSRBC，便可获得纯 T 淋巴细胞，而 B 淋巴细胞可直接取自分层液的界面。材料及试剂：a)新鲜豚鼠血b)兔红细胞（ RRBC）c)溴花二氨基异硫氢化物（AET ）d)淋巴细胞分层液e)
3、其它 Hanks 液，含小牛血清的 199 培养液，无菌生理盐水，3.5%氯化钠溶液，离心机等。方法：1.AETRRBC 制备（1）.AET 溶液的制备称取 AET 粉剂 402 毫克，溶于 10 毫升蒸馏水中，使成为 0.143M 溶液，用 4NNaOH 溶液调 pH9.0。该溶液必须新鲜配制，不宜久存。（2）.AET 处理 RRBC取洗涤好压积的 RRBC，按一份压积 AETRRBC 加入 4 份新鲜配制的 pH9.0 的 AET 溶液充分混匀置 37水浴 15 分钟，每隔 5 分钟摇匀一次。取出加冷无菌生理盐水至离心管口（12 厘米） 1800 转/分离心 5 分钟。连续洗涤 35 次，
4、每洗一次，必须充分摇匀，以减少 AETRRBC 粘附成团，并观察有无溶血。若有溶血现象，则用含小牛血清的 199 培养基再洗一次，最后配成 10%AETRRBC 悬液，置 4保存，不得超过 5 天。（3）.1%AET RRBC 的配制：将预先配制并保存于 4冰箱的 10%浓度的 AETRRBC，以含 10%小牛血清的 199 培养液稀释至 1%。2.从新鲜豚鼠血液分离单个核细胞，操作见后试验。3.AETE 花环试验：将分离的单个核细胞（2106/毫升）与等量 1%AETRRBC 混合，置 37水浴 15 分钟，每隔 5 分钟摇匀一次，分装数管，每管 23 毫升，低速离心（1000 转/ 分钟）
5、5 分钟后，移至 4 冰箱 45 分钟。4.T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞的分离将形成 E花环的细胞悬液，再用淋巴细胞分层液分离，吸取界面云雾状的细胞，即为富含 B 淋巴细胞群。沉淀于管底的 E花环，用 Hanks 液洗一次后，加双蒸水 3 毫升处理 3分钟，低渗裂解 E花环周围的 RRBC，立即加 3.5%氯化钠溶液 1 毫升，使还原为等渗，低速离心沉淀，即得富含 T 淋巴细胞群。过敏性紫癜血清 IgA1 刺激脐静脉内皮细胞分泌炎症介质的实验研究 【摘要】：目的过敏性紫癜（HSP）是儿童期最常见的系统性小血管炎。尽管已知血管内皮损伤是 HSP 主要病理变化，但其血管内皮损伤机制尚不清楚。本研究
6、通过观察 HSP 血清及血清 IgA1 刺激下人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分泌炎性细胞因子水平及 HUVECs 中细胞间黏附分子-1 （ICAM-1 ）和核因子- B（NF-B ）相关基因及蛋白表达的变化，初步探讨儿童过敏性紫癜血清 IgA1与血管内皮损伤的关系及血管内皮细胞损伤的分子机制。方法1.血清采集及 IgA1 的提取：本院儿科住院确诊为 HSP 的急性期患儿 10 例及 10 例健康体检儿童均于清晨空腹抽取外周静脉血 5ml，分离血清；Jacalin 亲和层析法提取血清 IgA1。2.实验方法：采用体外细胞培养方法，实验分三组观察：HSP 组，正常对照组，空白对照组。HSP 组分
7、别用患儿血清及患儿血清 IgA1 与 HUVECs 共培养；正常对照组分别用正常儿童血清及正常儿童血清 IgA1 与 HUVECs 共培养；空白对照组用无血清培养基与HUVECs 共培养。培养 12h 后分别检测各组上清液炎性细胞因子水平。采用 MTT 比色法检测各组 IgA1 刺激下 HUVECs 吸光值，观察不同浓度 IgA1 刺激HUVECs 增殖情况。实时荧光定量聚合酶链反应（Real time PCR）和蛋白质印记技术（ Westernblot）检测IgA1 刺激下 HUVECs 中 NF-B 和 ICAM-1mRNA 及蛋白表达。结果1. HSP 患儿血清及血清 IgA1 分别与
8、HUVECs 共培养 12h 后，HSP 组上清液 IL-8、TNF- 和 NO 水平均明显高于正常对照组和空白对照组（P0.05 ） ；2.血清 IgA1 刺激 HUVECs 增殖实验中，正常对照组和 HSP 组 IgA1 均可刺激 HUVECs增殖（p0.05） ；随着 IgA1 浓度的增加，两组 HUVECs 增殖程度均有相应增高趋势；在 IgA1 相同浓度下，与正常对照组相比，HSP 组 IgA1 刺激 HUVECs 增殖程度更明显（p0.05） 。3.HSP 组血清 IgA1 刺激下 HUVECs NF-B 和 ICAM-1mRNA 表达量明显高于正常对照组及空白对照组（分别 P0.
9、05，P0.01） ，且 HSP 组两者的蛋白表达量也明显高于正常对照组和空白对照组（P0.01） 。结论1. HSP 急性期患儿血清 IgA1 可诱导体外培养的 HUVECs 活化并分泌炎性介质。2. IgA1 可能通过激活 NF-B 通路,上调血管内皮细胞炎性介质的表达而导致内皮细胞损伤。【关键词】：过敏性紫癜 人脐静脉内皮细胞 炎症介质 核因子- B 【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012基因多态性编辑本词条缺少信息栏，补充相关内容使词条更完整，还能快速升级，赶紧来编辑吧！多态性（polymorphism）是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型（gen
10、otype ）或等位基因（allele ） ，亦称 遗传多态性（genetic polymorphism）或基因多态性。从本质上来讲，多态性的产生在于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。对于一个体而言，基因多态性碱基顺序终生不变，并按孟德尔规律世代相传。生物群体基因多态性现象十分普遍，其中，人类基因的结构、表达和功能，研究比较深入。人类基因多态性既来源于基因组中重复序列拷贝数的不同，也来源于单拷贝序列的变异，以及双等位基因的转换或替换。按引起关注和研究的先后，通常分为 3 大类：DNA片段长度多态性、DNA 重复序列多态性、单核苷酸多态性 。目录1
11、基因多态性分类 DNA 片段长度多态性 DNA 重复序列多态性 单核苷酸多态性 2 遗传背景知识 遗传和变异 基因结构和遗传表型 3 基因多态性与遗传 错义突变 无义突变 同义突变 移码突变 剪接异常 4 基因多态性的医学意义 临床医学方面 遗传病学方面 预防医学方面 1基因多态性分类编辑生物群体基因多态性现象十分普遍，其中，人类基因的结构、表达和功能，研究比较深入。人类基因多态性既来源于基因组中重复序列拷贝数的不同，也来源于单拷贝序列的变异，以及双等位基因的转换或替换。按引起关注和研究的先后，通常分为 3 大类：DNA片段长度多态性、DNA 重复序列多态性、单核苷酸多态性 。DNA 片段长度
12、多态性DNA 片段长度多态性（FLP） ，即由于单个碱基的缺失、重复和插入所引起限制性内切酶位点的变化，而导致 DNA 片段长度的变化。又称限制性片段长度多态性，这是一类比较普遍的多态性。DNA 重复序列多态性DNA 重复序列的多态性（RSP） ，特别是短串联重复序列，如小卫星 DNA 和微卫星DNA，主要表现于重复序列拷贝数的变异。小卫星（minisatellite）DNA 由 1565bp 的基本单位串联而成，总长通常不超过 20kb，重复次数在人群中是高度变异的。这种可变数目串联重复序列（VNTR）决定了 小卫星 DNA 长度的多态性。微卫星（microsatellite ）DNA的基本
13、序列只有 18bp，而且通常只重复 1060 次。单核苷酸多态性单核苷酸多态性（SNP） ，即散在的单个碱基的不同，基因组中单核苷酸的缺失,插入与重复序列不属於 SNP，但更多的是单个碱基的置换，在 CG 序列上频繁出现。这是目前倍受关注的一类多态性。SNP 通常是一种双等位基因的（biallelic） ，或二态的变异。 SNP 大多数为转换，作为一种碱基的替换，在基因组中数量巨大，分布频密，而且其检测易于自动化和批量化，因而被认为是新一代的遗传标记。2遗传背景知识编辑遗传和变异各种生物都能通过生殖产生子代，子代和亲代之间，不论在形态构造或生理功能的特点上都很相似，这种现象称为遗传（hered
14、ity ） 。但是，亲代和 子代之间，子代的各个体之间不会完全相同，总会有所差异，这种现象叫变异（variation） 。遗传和变异是生命的特征。遗传和变异的现象是多样而复杂的，正因为如此，才导致生物界的多种多样性。基因结构和遗传表型生物体所具有的遗传性状称为表型或表现型（phenotype） 。生物体所具有的特异基因成分称为基因型（genotype） 。表型是基因型与环境因素相互作用的结果。遗传物质是相对稳定的，但是又是可变的，遗传物质的变化以及由其所引起表型的改变，称为突变（mutation） 。遗传物质 突变包括染色体畸变和 基因突变。 基因突变是染色体中某一点上发生化学改变，所以又称为
15、点突变（pointmutation） 。基因结构和遗传表型的研究是深入了解脂蛋白代谢缺陷症的分子生物学基础，逆向遗传学方法（reversegeneticapproach ）则使其有可能在蛋白质水平系统地分析结构和功能的关系。基因多态性在人群中，其基因型频率的分布符合 Hardy-Wenberg 平衡。3基因多态性与遗传编辑基因的多态性直接导致了生物繁殖过程中转录和翻译的选择多样性，使得遗传密码传递既保持一定的准确性，又有一定的宽容度，这种繁殖的适度柔性对生物界的稳定和多样化非常重要。基因多态性的碱基的取代、缺失、插入引编码序列的核苷酸顺序改变，在转录和翻译合成蛋白质的过程中，造成遗传密码的改变
16、、蛋白质肽链中的片段缺失、mRNA 剪接异常、或启动子的突变及非转录区的突变等。有的使基因的转录水平或活性的增强或降低、对多肽链中氨基酸的排列顺序产生影响。这些基因多态性在生物学的作用可分为：错义突变错义突变(missense mutation)指 DNA 分子中碱基对的取代，使得 mRNA 的某一密码子发生变化，由他所编码的氨基酸就变成另一种不同的氨基酸，使得多肽链中氨基酸的顺序也相应地发生改变。无义突变无义突变(nonsense mutation)指由于碱基取代使原来可翻译某种氨基酸的密码子变成了终止密码子。例如 UAU（氨酸）颠换成 UAA（终止密码子）使多肽链的合成到此终止，形成一条不
17、完整的多肽链，使蛋白质的生物活性和功能改变。转换也可引起无义突变。无义突变和 DNA 片段的缺失都可以导致肽链中的片段缺失，致使基因编码的蛋白质失去原有的功能。同义突变同义突变(same sense mutation)指碱基的取代并不都是引起错义突变和翻译终止，也就是虽然碱基被取代了，但蛋白质水平上没有引起变化，氨基酸没有被取代。移码突变移码突变 (frame-shifting mutation)指在编码序列中单个碱基、数个碱基的缺失或插入，片段的缺失或插入可使突变位点之后的三联体密码子阅读框发生改变，不能编码原来的正常蛋白质。移码突变不仅使翻译后的肽链中氨基酸序列发生改变，而且也导致肽链中的
18、大片段缺失。剪接异常剪接异常是指数个碱基的缺失、片段缺失、染色体突变等均有可能造成 mRNA 剪接位点的缺失和异常，都可以导致 mRNA 的错误剪接，产生异常的 mRNA，最终产生异常的表达产物。如果点突变发生内含子的剪切位点，则影响 mRNA 的剪接：或是原有的剪接位点消失，或是产生新的剪切位点。4基因多态性的医学意义编辑基因多态性的研究，为临床医学、遗传病学和预防医学的发展研究开拓了新的领域。临床医学方面人类基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性，疾病临床表现的多样性（clinical phenotype diversity） ，以及对药物治疗的反应性上都起着重要的作用。基因型与
19、发病率早期有关基因多态性的临床上研究是从 HLA 基因开始的。如 HLA-B27 等位基因与强直性脊椎炎发生率的密切关联，分析基因型在疾病发生易感性方面的作用，就可作为诊断的依据。通过对基因多态性与疾病的易感性的联系研究，可阐明人体对疾病、毒物和应激的易感性。如 P53 抑癌基因多态性与肿瘤发生及转移的关系研究，就是从基因水平揭示人类不同个体间生物活性物质的功能及效应存在着差异的本质。疾病基因多态性与临床表型多样性的联系已受到重视，如肿瘤等多基因病的临床表型往往多样化，阐明基因型（genotype ）与表型(phenotype) 之间的联系在认识疾病的发生机理、预测疾病的转归等方面也有重要的作
20、用。药物代谢与致病基因致病基因的多态性使同一疾病的不同个体，在其体内生物活性物质的功能及效应出现差异，即疾病基因多态性影响药物代谢的过程及清除率，导致治疗反应性上悬殊，从而影响治疗效果。基因多态性研究使得临床医生将有可能预断，在同样的致病条件下，不同的个体会出现什么样的病理反应和临床表现。按照基因多态性的特点用药，将会使临床治疗符合个体化的要求。如高血压的治疗，将根据基因多态性的研究选择更具针对性的药物，调整其剂量，而不是不加选择地使用 ACEI、钙拮抗剂或交感神经受体 阻断剂。合并症的防治也会更个体化，更具针对性。遗传病学方面基因多态性的研究对于遗传病具有双重意义。首先，基因的有害突变，包括
21、经典的点突变和已知的动态突变，都有可能成为生物体发病的根源，导致遗传病的发生和发展；其次，基因多态性位点众多，是很好的遗传标记，可以在遗传病的研究和临床诊断中发挥重要的作用。多态性导致遗传疾病重复序列多态性作为遗传病的病因，如 CCG，CTG 和 CAG 这样的三核苷酸重复序列，当其拷贝数过度增高时可以引起强直性肌营养不良等。三核苷酸拷贝数的扩增或突变发生在世代传递过程中，由于拷贝数在世代间的改变，它被称为代际突变。目前代际突变疾病大多是些神经系统的退行性疾病，也有少数肿瘤。代际突变疾病的发现提示序列拷贝数的多态性能够成为遗传病的病因。点突变引起的疾病：从镰刀状细胞贫血开始，突变引起各种遗传病
22、的例子愈来愈多，遗传性肿瘤也逐渐被认识。多态性适于遗传标记绝大多数 DNA 多态性并不引起遗传病，反而可作为遗传标记来使用。例如：包括FLP 位点、 微卫星 和小卫星 DNA 等各种多态性标记，都已广泛用于遗传病的连锁诊断。利用各条染色体上位置已知的众多的多态性标记，通过患病家系的连锁分析，可以找到多基因病的致病基因或相关基因的位置，并为这些基因的分离克隆提供依据。在疾病的关联分析和病因学研究方面，通过比较患病群体和正常群体，可以发现两组间多态性位点的特定等位基因频率有显著差别，则表明该位点与该疾病相关联。使用多态性标记的关联分析既可以提示相关基因存在的位置，也有助于发病机理的阐明。基因多态性
23、还可以用于疾病的分型与治疗，即根据患者疾病多态性的基因型来解释疾病的病因和临床表现。预防医学方面在预防医学方面，基因多态性的研究涉及的范围广泛，包括基因多态性与病因未知的疾病关系的研究，也包括对已知特定环境因素致病易感基因的筛选。由于基因多态性种族差异明显，因此在基因-环境交互作用模式上，不同的种族之间有可能不同。所以，开展我国人群的基因多态性与环境的作用关系的研究具有重要的意义。基因多态性的研究在职业病医学中则更具有实际的意义。对易感基因和易感性生物标志物的分析，将某些携带敏感基因型的人甄别开来，采取针对性预防措施，提高预防职业性危害工作的效率。对特定的污染物易感人群和耐受人群的基因多态性研究，有助于阐明环境因素的致病机制，也推动了遗传易感性标志物的研究。
