1、食品微生物检测讲义12 级生物技术 1 班项目一 食品微生物检测的准备任务描述任务 1 食品微生物检测基础知识的准备任务 2 食品微生物检测条件认识、设计企业微生物实验室任务 3 食品生产、检测过程中微生物污染与控制一任务 4 食品生产、检测过程中微生物污染与控制二任务 5 微生物菌落特征的识别任务 6 微生物装片制作及观察任务 7 微生物的生化鉴定任务 8 环境样品的采集与制备任务 9 食品样品的采集与制备任务 1 食品微生物检测基础知识的准备学习目标1、掌握食品微生物检测的概念、范围和指标；2、理解食品微生物检测的内容；3、了解食品微生物检测的发展。学习内容第一节 食品微生物检测的概念和意
2、义 1第二节 食品微生物检测的内容和范围 2第三节 食品微生物检测的指标 3第四节 食品微生物检测的发展 3第一节 食品微生物检测的概念和意义民以食为天。食品和水及空气一样，是人类生活的必需品，丰富的食品，是人类生存的最基本保证，是人类生命的能源。可是，食品一旦被附着、混入或生成了对人类健康有害、有毒的物质，尤其是被微生物污染时，就会发生食物中毒性疾病，乃至危及人类生命安全。在自然界中到处都存在着各种无数的微生物，在食品的生产制作、加工、贮藏、运输、销售等各个环节，以及食品暴露在自然环境中时，均不可避免的会经常遭受到微生物的污染。特别是一些直接危害人类健康的病原微生物均有可能进入到食品中，被人
3、摄食后，将造成疾病的流行，引起社会的不安，酿成严重的经济损失。因此，食品的卫生质量与人的健康关系极为密切，是确保人类健康与生命安全的不容勿视的大事。随着人民生活水平的提高，对食品的质量和食品的安全性要求越来越高，不仅要求营养丰富、美味可口，而且要卫生经济，因而对食品进行微生物检测至关重要。食品微生物检测是应用微生物学的理论与方法，研究外界环境和食品中微生物的种类、数量、性质、对人和动物所产生的影响及其检测方法与指标的一门学科。它不仅与普通微生物学、食品微生物学、医学微生物学、兽医微生物学、畜牧微生物学、农业微生物学、工业微生物学、环境微生物学与食品学等有关学科相互融合，而且还涉及物理学、生物学
4、、普通化学、分析化学、生物化学等基础学科，又与传染病学、流行病学、人兽共患病学、寄生虫病学、环境卫生学等专业学科相交。其深广的基础理论与科学的方法，不仅可以检测出各类食品中的有害微生物，确定该食品的卫生质量及其对人类生命的安全性；还可指导人们对食品加工工艺的不断改进、创新、以使食品加工制作、贮运、销售等环节的卫生管理科学化，使食品的数量和质量日趋提高，满足人类生活水平的需求。是食品行业全面实行管理体系与质控体系的极为重要的手段。因此，食品微生物检测具有重要的意义。食品微生物检测方法为食品监测必不可少的重要组成部分。首先，它是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一
5、；其次，通过食品微生物检测，可以判断食品加工环境及食品卫生情况，能够对食品被细菌污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物的食物中毒的防治措施；再次，食品微生物检测是以贯彻“预防为主”的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒和人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；最后，它对保证产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重大意义。总的来说，食品微生物检测的目的就是要为生产出安全、卫生、符合标准的食品提供科学依据。第二节 食品微生物检测的内容和范围（一）食品微生物检测的内容食品微生物检测的内容从面向食品加工过程的角度看，包括食品生产环境、原料
6、、加工过程、成品运输和保存全过程的微生物检测；从面向微生物的对象看，描述了各种指标菌的生物学特性和常规检测方法，有的补充了一些特殊检测方法；从面向食品的对象看，描述了每种食品的常见微生物，样品的采集、处理、检测的方法和程序以及有关材料和用品；从学科的逻辑结构看，食品微生物检测分为食品微生物学基础知识、微生物学基础实验、食品中常见的微生物检测、常见食品的微生物学检测四部分。（二）食品微生物检测的范围食品不论在产地或加工前后，均可能遭受微生物的污染。污染的机会和原因很多，一般有：食品生产环境的污染，食品原料的污染，食品加工过程的污染等根据食品被细菌污染的原因和途径可知，食品微生物检测的范围包括以下
7、几点：1生产环境的检测车间用水、空气、地面、墙壁等。 2原辅料检测包括食用动物、谷物、添加剂等一切原辅材料。3食品加工、储藏、销售诸环节的检测。包括食品从业人员的卫生状况检测、加工工具、运输车辆、包装材料的检测等。4食品的检测重要的是对出厂的成品食品、可疑食品及食物中毒食品的检测。第三节 食品微生物检测的指标食品微生物检测的指标就是根据食品卫生的要求，从微生物学的角度，对不同食品所提出的与食品有关的具体指标要求。我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项。一、菌落总数菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得 1g 或 1mL 检样中所含细菌菌落的总数。它可以反应
8、食品的新鲜度、被细菌污染的程度、生产过程中食品是否变质和食品生产的一般卫生状况等。因此它是判断食品卫生质量的重要依据之一。二、大肠菌群包括大肠杆菌和产气杆菌的一些中间类型的细菌。这些细菌是寄居于人及温血动物肠道内的常居菌，它随着大便排出体外。食品中如果大肠菌群数越多，说明食品受粪便污染的程度越大。故以大肠菌群作为粪便污染食品的卫生指标来评价食品的质量，具有广泛的意义。三、致病菌致病菌即能够引起人们发病的细菌。对不同的食品和不同的场合，应选择一定的参考菌群进行检测。例如：海产品以副溶血性弧菌作为参考菌群，蛋与蛋制品以沙门氏菌、金法国科学家路易斯 巴斯德 (1822-1895)被后人誉为“微生物学
9、之父”黄色葡萄球菌、变形杆菌等作为参考菌群，米、面类食品以蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、霉菌等作为参考菌群，罐头食品以耐热性芽胞菌作为参考菌群等等。四、霉菌及其毒素我国还没有制定出霉菌的具体指标，鉴于有很多霉菌能够产生毒素，引起疾病，故应该对产毒霉菌进行检测。例如：曲霉属的黄曲霉、寄生曲霉等，青霉属的桔青霉、岛青霉等，镰刀霉属的串珠镰刀霉、禾谷镰刀霉等等。五、其它指标微生物指标还应包括病毒，肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马立克氏病毒、口蹄疫病毒，狂犬病病毒，猪水泡病毒等；另外，从食品检测的角度考虑，寄生虫也被很多学者列为微生物检测的指标：如旋毛虫，囊尾蚴，住肉孢子虫、蛔虫，肺吸虫，弓形体，螨，姜
10、片吸虫，中华分枝睾吸虫等等。第四节 食品微生物检测的发展学科发展犹如生物进化一样，在继承和遗传的基础上，发展和变异有逻辑自主的内动力和社会需求外动力，受人类利益的约束和选择。食品微生物学检测的发展大致经历了以下几个发展阶段。一、致病菌检测阶段法国科学家巴斯德（LPasteur，1822-1895 ）发现了酒类酿造是酵母菌的作用，而酒类变质则是由于外界杂菌污染所致；并发现，刚发酵完毕的酒，在沸点之下文火加热，可以杀死酒中存在的微生物，酒不会再变质。这就是沿用至今的巴氏消毒法。巴斯德用更加生动巧妙的细颈瓶实验证实了空气中微生物的存在。空气可以进入细颈瓶内，而附着有微生物的尘埃则不能向上进入到瓶内加
11、热过的酵母浸液，从而保证了酵母浸液长时间的洁净。巴斯德又将若干组经加热后的酵母浸液瓶的瓶口密封，带到不同地域和不同高度的山峰，然后陆续分组折断瓶颈，使带着尘埃的空气进入。实验向人们证实，越是人迹罕至的清洁环境，以及随着山峰高度的增加，微生物的粒子越少，对微生物在空气中密度分布的差异做了首次报道。他的研究向人们揭示，空气中含有大量微生物，发酵和腐败是微生物生长繁殖的结果。图 1.1 鹅颈烧瓶实验众所周知，传染病是人类健康的大敌。从古至今，鼠疫、伤寒、霍乱、肺结核等许多可怕的病魔夺去了人类无数的生命。人类要战胜这些凶恶的疾病，首先要弄清楚致病的原因。而第一个发现传染病是由病原细菌感染造成的人就是罗
12、伯特 科赫，他堪称是世界病原细菌学的奠基人和开拓者。19 世纪末至 20 世纪初，在巴斯德和科赫（Koch）光辉业绩的影响下，国际上形成了寻找病原微生物的热潮。由于国际间交往的增加，尤其是第一次世界大战的爆发，一些烈性传染病的全球性大流行，促使人们必须将视线集中在病原微生物的研究方面，而且似乎形成了一种观念，一提到微生物就会联想到疾病与灾难，思想认识上产生了一定的片面性。故医学微生物学受到了更多的关注，有关食品微生物学方面的研究也主要是检测致病菌。二、指示菌检测阶段20 世纪末，重要病原微生物已大量被发现，抗生素的问世，使细菌性传染病对人类生命造成严重威胁的阶段逐步宣告结束，微生物学的研究在朝
13、着多元化的方向迅速发展。于是，与食品安全性有关的六大问题，即营养失控、微生物致病、自然毒素、环境污染物、人为加人生物链的有害化学物质、其他不确定的饮食风险等，就成了社会关注的焦点。其中重点是微生物污染食品致病。如在我国，80的传染病是肠道传染病。为了预防肠道传染病，各种食品微生物的检测方法和检测标准的制定，是食品微生物检测的重要研究内容之一。通过这些方法和标准，可以检测并判断水、空气、土壤、食品、日常用品以及各类公共场所的安全卫生状况。了解这些环境条件和物品安全卫生状况的目的，一方面是为了预防致病性微生物通过这些媒介感染人群，引起疾病的爆发流行；另方面也是为了避免不符合质量或安全卫生标准的罗伯
14、特 科赫（ 18431910）细菌学鼻祖，传染病的克星，细菌学的奠基人和开拓者食品、药品、化妆品等流入市场，给广大消费者带来危害，造成损失。但从样品中直接检测目的病原微生物有一定难度，原因是在环境中病原微生物数量少、种类多、生物学性状多种多样，检测和鉴定方法比较复杂。因此，需要寻找某些带有指示性的微生物这些微生物应该在环境中存在数量较多，易于检出，检测方法较简单，而且具有一定的代表性。依据这些指示性微生物检出的情况，可以判断样品被污染的程度，并间接指示致病微生物有无存在的可能，以及对人群是否构成潜在的威胁。指示菌（或称指标菌）是在常规安全卫生监测中，用以指示检品（检测样品）卫生状况及安全性的指
15、示性微生物。常规检测指示菌的目的，主要是以安全卫生指示菌在检品中存在与否以及数量的多少为依据，对照国家卫生标准，对检品的饮用、食用或使用的安全性做出评价。指示菌可分为三种类型：第一种类型的指示菌是为了评价被检样品的一般卫生质量、污染程度以及安全性，最常用的是菌落总数、霉菌和酵母菌数。第二种类型是特指粪便污染的指示菌，主要指大肠菌群，其他还有肠球菌、亚硫酸盐还原梭菌等。它们的检出标志着检品受过人、畜粪便的污染，而且有肠道病原微生物存在的可能性。第三种是其他指示菌，包括某些特定环境不能检出的菌类，如特定菌、某些致病菌或其他指示性微生物。这些指示菌，在不同的样品中有不同的指示意义。三、微生态制剂检测
16、阶段19 世纪人们就发现并开始认识厌氧菌（巴斯德，1863） ，但直到 20 世纪 70 年代，了解到厌氧菌类中主要是无芽孢专性厌氧菌后，才开始重视厌氧菌的研究。厌氧菌广泛分布在自然界，如土壤、沼泽、湖泊、海洋及河流的沉渣和淤泥，以及动、植物体内，尤其是广泛存在于人体的皮肤和肠道。它们在人出生后数小时就定居，是人体中存在的主要微生物菌群之一。生态平衡时，与人体“和平共处”，成为人体抵抗疾病的第一道防线；生态失调时，成为人体感染的主要条件致病菌，形成厌氧菌感染症。由此，市场上出现了以乳酸菌、双歧杆菌为主，以调节生态平衡为目的的各种微生态制剂，检测其菌株的特性和数量就成了 20 世纪末食品微生物检
17、测的一项重要内容。四、食品微生物检测方法的新进展近年来，随着分子生物学利微电子技术的飞速发展，快速、准确、特异检测微生物的新技术、新方法断涌现，微生物检测技术由培养水平向分子水半迈进，并向仪器化、自动化、标准化方向发展，提高了食品微生物检测工作的高效性、准确性和可靠性。1. 电阻抗法电阻抗法是近年发展起来的一项生物学技术，已经开始应用于食品微生物的检测。其原理是细菌在培养基内生长繁殖的过程中，将会使培养基中的大分电惰性物质如碳水化合物、蛋白质和脂类等，代谢为具有电活性的小分子物质，如乳酸盐、醋酸盐等，这些离子态物质能增加培养基的导电性，使培养基的阻抗发生变化，通过检测培养基的电阻抗变化情况，判
18、定细菌在培养基中的生长繁殖特性，即可检测出相应的细菌。该法目前已经用于细菌总数、霉菌、酵母菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等的检测。如AOAC99138 食品中沙门氏菌电阻抗检测法。2. 微量生化法主要是指市售的微生物鉴定用试剂盒，常见的有 MICRO-ID、API 等。API 由 20 个含干燥培养基的微管组成，其中的培养基用于进行酶促反应或糖发酵试验。检测时将预处理的菌悬液加入微管中培养后观察颜色变化，并纪录，输入 APILAB Plus 软件得出结果。API 创建了独特的数值鉴定法，可鉴定 15 个系列、600 多个细菌种，并具有简单、快速、可靠等特点。3. 快速酶触反应及代谢产物
19、的检测快速酶触反应是根据细菌在生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，根据酶的特性，选用相应的底物和指示剂，反应的测定结果有助于细菌快速诊断。如美国3MPetiffilmTM 微生物测试片可分别快速测定细菌总数、霉菌、酵母菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠菌群等。4. 分子生物学技术(1) 核酸探针技术。核酸探针是指带有标记的特异 DNA 片断。根据碱基互补原则，核酸探针能特异性地与目的 DNA 杂交，最后用特定的方法测定标记物。基因探针技术虽已广泛应用，但主要问题是灵敏度小够高，使基因探针技术应用受限制。(2) 聚合酶链式反应 (PCR)技术。其原理为通过加热使双链 DNA 经裂解成两条单
20、链，成为引物和 DNA 聚合酶的模板；然后降低温度，使寡聚核苷酸引物与 DNA 分子上的互补序列退火。PCR 技术是一项全新的技术，快速、灵敏、准确，在细菌诊断方面具有广阔的前景。5. 免疫学方法检测细菌抗原和抗体的技术(1) 荧光抗体检测技术 (IFA)。IFA 方法简便、快速经济，但有时受到样本中非特异性荧光的干扰，影响结果的判定，并且需要昂贵的荧光显微镜。(2) 免疫酶技术 (EIA)。(3) 免疫磁珠分离法 (IMS)。6. 仪器法(1) Bactometer 系统。Bactometer 系统主要由 BPU 电子分析器和培养箱组成。该系统是利用电阻抗、电容抗或总阻抗等参数的自动微生物检测系统。(2) 微型全自动荧光酶标分析仪(MiniVIDAS) 。微型全 自动荧光酶标分析仪主要应用酶联荧光技术 (ELFA)，使用该仪器操作简便，只须加一次样品，按一次键，整个检测过程都由仪器自动完成。多数试验 50 分钟内结束 (不含增菌过程) ，无交叉污染。(3)全自动微生物分析系统 (VietkAMS)。此系统能同时进行 60-480 个样品分析，速度快，操作简单，结果准确。随着技术发展，新的微生物检测方法还将继续推出，今后食品微生物检测技术的发展方向是：(1)提高检测效率，即方便、快速和大批量；(2)试验条件标准化；(3)检测的高精度和高灵敏度。
