1、脂肪间充质干细胞移植治疗慢性阻塞性肺疾病中国组织工程研究 第 20 卷 第 41 期 20161007 出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research October 7, 2016 Vol.20, No.41www.CRTER.org研究原著郝术安，吴 琦，王茂均(天津医科大学研究生院，天津市 300070；天津市津南区咸水沽医院内科，天津市 300350； 3天津市海河医院呼吸科，天津市 300222)3212DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.41.015 ORCID: 0000-0001-8143-58
2、47(郝术安 )文章快速阅读：文题释义：慢性阻塞性肺疾病：是一种常见的以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病，气流受限进行性发展，与气道和肺脏对有毒颗粒或气体的慢性炎性反应增强有关。间充质干细胞减轻肺部炎症反应：大量研究证实间充质干细胞可以分化成肺上皮细胞，并诱导其表达气道和/或肺泡上皮细胞的标记，可表达 HLA ，HLA 以及其他共刺激分子，使得间充质干细胞可以成功逃避机体免疫监测。此外，它可以在损伤组织局部分泌一些生长因子和细胞因子，提高自由基清除酶的活性，增强机体的抗氧化能力，减轻脂质过氧化引起的损伤。另有研究表明到达损伤肺组织中的间充质干细胞能在下调促炎因子表达的同时上调抗炎细胞因
3、子的表达，从而起到减少甚至是中止炎症的作用。摘要背景：慢性阻塞性肺疾病是一种具有气流受限特征的以炎症为核心的慢性呼吸系统疾病。目的：探讨脂肪间充质干细胞对慢性阻塞性肺疾病大鼠的治疗作用。方法：健康雄性 SD 大鼠 60 只随机分成 3 组(n=20)，治疗组和模型组大鼠通过烟熏及气管内注入脂多糖的方法建立慢性阻塞性肺疾病模型，对照组大鼠不进行任何处理。造模后治疗组大鼠经尾静脉注射 CM-Dil 标记的脂肪间充质干细胞，模型组及对照组给予等量生理盐水，移植后 14 d，检测大鼠肺通气功能、炎症因子水平和肺组织病理学变化。结果与结论：与对照组比较，模型组和治疗组肺功能明显下降，治疗组肺功能较模型组
4、明显改善(P 0.05)； 治疗组肺泡灌洗液中白细胞总数、巨噬细胞数及中性粒细胞数均显著低于模型组(P 0.05)；治疗组肺泡灌洗液中白细胞介素 8、肿瘤坏死因子 、C- 反应蛋白水平低于模型组(P 0.05)； 与模型组相比，治疗组血清中超氧化物歧化酶活性显著增高、丙二醛水平显著降低(P 0.05)； 治疗组较模型组肺气肿样改变减轻；CM-Dil 标记的脂肪间充质干细胞能够归巢到慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织并存活；结果表明，脂肪间充质干细胞移植能改善慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能，减轻炎症反应，具有一定治疗作用。 关键词：干细胞；移植；慢性阻塞性肺疾病；脂肪间充质干细胞；炎症因子；细胞移植主题词：
5、肺疾病，慢性阻塞性；脂肪组织；间质干细胞移植；组织工程ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH郝术安，男，1981 年生，河北省唐山市人，汉族， 2006 年河北医科大学毕业，主治医师，主要从事呼吸内科研究。通讯作者：吴琦，博士，教授，天津市海河医院呼吸科，天津市 300222中图分类号:R394.2 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2016)41-06177-06 稿件接受：2016-07-276177Hao Shu-an, Attending physician, Graduate School, Tianjin Medical U
6、niversity, Tianjin 300070, China; Department of Respiratory Medicine, Xianshuigu Hospital of Jinnan District, Tianjin 300350, ChinaCorresponding author: Wu Qi, M.D., Professor, Department of Respiratory Medicine, Tianjin Haihe Hospital, Tianjin 300222, Chinawww.CRTER.orgAdipose-derived mesenchymal s
7、tem cell transplantation for treatment of chronic obstructive pulmonary diseaseHao Shu-an1, 2, Wu Qi3, Wang Mao-jun2 (1Graduate School, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 2Department of Respiratory Medicine, Xianshuigu Hospital of Jinnan District, Tianjin 300350, China; 3Department o
8、f Respiratory Medicine, Tianjin Haihe Hospital, Tianjin 300222, China)AbstractBACKGROUND: Chronic obstructive pulmonary disease is progressive respiratory disease characterized by airflow limitation.OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effect of adipose-derived mesenchymal stem cell transplanta
9、tion in rats with chronic obstructive pulmonary disease.METHODS: Sixty healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control, model and treatment groups (n=20 per group). Rat models of chronic obstructive pulmonary disease were made in the model and treatment group, while no treatment
10、was done in the control group. After modeling, rats in the treatment group were given tail vein injection of CM-Dil-labeled adipose-derived mesenchymal stem cells, and rats in the model and control groups given the same amount of normal saline. Rat pulmonary ventilation function, inflammatory factor
11、 level and pathological changes of the lung were detected at 14 days after cell transplantation.RESULTS AND CONCLUSION: After modeling, reduced lung function was found in rats with chronicobstructive pulmonary disease, but the cell transplantation significantly improved this reduction (P 0.05). Comp
12、ared with the model group, significantly reduced indexes were visible in the treatment group (P 0.05), including the total number of white blood cells, the number of macrophages and neutrophils, levels of interleukin-8, tumor necrosis factor and C-reactive protein in the bronchoalveolar lavage fluid
13、 as well as serum level of malondialdehyde, while serum superoxide dismutase activity was increased significantly in the treatment group (P 0.05). In the treatment group, emphysema-like changes were mitigated and CM-Dil-labeled adipose-derived mesenchymal stem cells were capable of homing to the lun
14、g tissue of rats with chronic obstructive pulmonary disease and survived. All these findings show that adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation can improve lung function of rats with chronic obstructivepulmonary disease, and reduce inflammatory response, which has for certain some thera
15、peutic effects. Subject headings: Pulmonary Disease, Chronic Obstructive; Adipose Tissue; Mesenchymal Stem Cell Transplantation; Tissue EngineeringCite this article: Hao SA, Wu Q, Wang MJ. Adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation for treatment of chronic obstructive pulmonary disease. Z
16、hongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(41): 6177-6182.0 引言 Introduction慢性阻塞性肺疾病是临床中常见的一种慢性疾病，多见于中老年患者活质量3-51-21.2 时间及地点 实验于 2014 年 1 月至 2015 年 10 月在天津医科大学动物实验室完成。 1.3 材料1.3.1 实验动物 64 只四五周龄雄性 SD 大鼠，体质量 200-250 g，购于天津市实验动物中心。1.3.2 主要试剂、仪器 超氧化物歧化酶测定试剂盒、丙二醛测定试剂盒(上海闳巨实业有限公司)；白细胞介素 8、白细胞介素 10、肿瘤坏死因子 ELIS
17、A 试剂盒(上海沪鼎生物技术有限公司) ；台式离心机(北京医用离心机厂)；显微镜(德国 Lica 公司) ；721 分光光度计( 上海第三分析仪器厂)；流式细胞仪(美国 Coulter 公司)。 1.4 实验方法1.4.1 实验分组 取 60 只 SD 大鼠随机分成 3 组，分别为对照组、模型组和治疗组，每组 20 只。治疗组和模型组制备慢性阻塞性肺疾病模型，对照组不进行造模。P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org，该病进展缓慢，但常反复6发作，使患者劳动能力显著降低，严重影响患者的生。该病致病因素很多，炎症反应是其主要发病机制，到目前为止尚
18、未找到有效的治疗方案。干细胞是一类能够在特定条件下分化成为各种组织器官的细胞8-97，目前已有大量研究将干细胞运用于治疗各种10-11自身免疫性疾病及其他多种疾病，脂肪间充质干细胞是继骨髓干细胞之后干细胞研究领域中的又一热点。实验旨在探讨脂肪间充质干细胞移植对慢性阻塞性肺疾病大鼠的治疗作用。1 材料和方法 Materials and methods1.1 设计 随机对照动物实验。61781.4.2 脂肪间充质干细胞的分离、培养10-11取 4 只 SD 大鼠，以颈椎脱臼法处死，分离出腹股沟及附睾处脂肪组织，PBS 冲洗，用剪刀剪成乳糜样的细小颗粒，取少量放入离心管中，加入 0.1%型胶原酶，用
19、胶头滴管将混合液吹打混匀，使剪碎的脂肪组织呈悬浮状态，于 37 消化 120 min，离心管中加入低糖 DMEM 完全培养基，用胶头滴管吹打均匀，1 500 r/min 离心 10 min，弃去上清液，加入PBS 冲洗 2 遍，加入完全培养基，用胶头滴管吹打至悬浮状态，吸取少量悬液接种于培养皿中，置于 37 ，体积分数为 5%CO2 培养箱中培养，培养第 3 天时进行第 1 次换液，之后隔日换液 1 次，培养皿中细胞达 80%-90%融合时，加入 0.25%胰酶消化，并按 12-13 的比例进行传代培养。取第 5 代细胞贴壁融合达 80%时向其中加入含 4 mg/L CM-DiI 的培养基，3
20、7 孵育 30 min，PBS 冲洗 2 遍，荧光显微镜下观察细胞标记情况，然后消化细胞传代培养。1.4.3 慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立 参照任薇等12-13方法，治疗组和模型组给予生理盐水 10 mL/(kg?d)灌胃 4 周后开始造模，造模第 1 天、第 14 天，腹腔注射 6%水合氯醛麻醉大鼠，气管注入脂多糖 200 L ，第 2-28 天(第 14 天除外) 每天上午将大鼠置于密封的 1 m3烟室中，持续吸入香烟烟雾 30 min(滁州烟卷厂生产的红三环香烟，焦油量 19 mg，尼古丁 1.2 mg)，每天熏 1 次，每次 15 支香烟，同时每天继续用生理盐水灌胃，最终以大鼠出现频
21、繁咳嗽作为判断造模成功的标准。1.4.4 脂肪间充质干细胞移植 造模成功后 1 周，对照组及模型组大鼠尾静脉注射 0.5 mL 生理盐水，治疗组大鼠尾静脉注射 CM-Dil 标记的脂肪间充质干细胞悬液 0.5 mL(1106)。1.4.5 肺功能仪检测大鼠肺通气功能 细胞移植后 14 d，各组大鼠腹腔注射 8%水合氯醛麻醉，行气管切开后迅速插入 Y 形气管插管，Y 形气管插管的一端连接呼吸流量换能器，另一端连接三通管，通过 BL-420S生物机能实验系统记录一段平静呼吸曲线后，在呼气末以注射器经三通管迅速向气管内打 6 mL 空气，此过程相当于大鼠被动深吸气，然后立即将注射器移开，让气体自然呼
22、出，计算各组大鼠 1 s 时间用力呼出量(FEV1)、1 s 时间用力呼出量与用力肺活量之比(FEV1/FVC)、最大呼气中期流速(MMEF)、最大呼气流量 (PEF)测定肺通气功能。 1.4.6 肺泡灌洗液中各类白细胞计数及白细胞介素 8、肿瘤坏死因子 、C- 反应蛋白水平 细胞移植后 14 d，每组随机取 7 只大鼠，打开胸腔，使气管及双肺暴露于ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAHwww.CRTER.org手术视野，切开气管，用血管钳夹闭右侧主支气管，向左肺内注入生理盐水进行灌洗，灌洗液在左肺停留数秒后抽出灌洗液，重复以上操作过程 3 次，收集
23、 3 次肺泡灌洗液。取少量肺泡灌洗液滴入离心管中，1 500 r/min 离心 10 min，胶头滴管吸出离心管中的上清液，按照 ELISA 试剂盒说明书测定肺泡灌洗液中白细胞介素 8、肿瘤坏死因子 及 C-反应蛋白水平。吸取 10 L 肺泡灌洗液滴入细胞计数板，于低倍镜下计数位于四角的四个大方格中的细胞数。另取少许沉淀细胞涂片，进行瑞氏染色，选取细胞计数板上的 100 个白细胞，根据细胞形态特点进行分类计数，求出各种白细胞所占的百分率，再以细胞总数求得肺泡灌洗液中各类白细胞的绝对值。 1.4.7 血清中超氧化物歧化酶和丙二醛水平 细胞移植后 14 d，每组随机取 7 只大鼠，从大鼠颈动脉抽取
24、少量血液。以硫代巴比妥酸反应比色法检测血清中丙二醛水平。以黄嘌呤氧化法检测血清中超氧化物歧化酶活性。 1.5 主要观察指标 肺通气功能；肺泡灌洗液中各类白细胞计数及白细胞介素 8、肿瘤坏死因子 、C- 反应蛋白水平；血清中超氧化物歧化酶和丙二醛水平；大鼠肺组织病理变化。1.6 统计学分析 所有实验数据以 x_s 表示，用 SPSS 17.0 软件对实验数据进行两样本 t 检验分析，P 0.05 为差异有显著性意义。2 结果 Results2.1 实验动物数量分析 参加实验数量 60 只，进入结果分析数量60 只，中途无脱落。2.2 各组大鼠肺通气功能检测结果 与对照组比较，模型组和治疗组肺功能
25、明显下降，治疗组肺功能较模型组明显改善(P 0.05)。各组大鼠肺通气功能指标比较见表 1。 2.3 肺泡灌洗液中细胞计数与分类 模型组肺泡灌洗液中白细胞总数、巨噬细胞数及中性粒细胞数均显著高于对照组(P 0.05)，治疗组肺泡灌洗液中白细胞总数、巨噬细胞数及中性粒细胞数均显著低于模型组(P 0.05)。各组大鼠肺泡灌洗液中细胞计数比较见表 2。 2.4 各组大鼠血清中白细胞介素 8、肿瘤坏死因子 、C-反应蛋白水平 治疗组白细胞介素 8、肿瘤坏死因子 、C- 反应蛋白水平低于模型组(P 0.05)，但还高于对照组(P 0.05)，见表 3。2.5 各组大鼠血清中超氧化物歧化酶和丙二醛水平 与
26、模型组相比，治疗组血清超氧化物歧化酶活性明显增高、丙二醛水平显著降低(P 0.05)，见表 4。6179_www.CRTER.org表 1 各组大鼠肺通气功能指标比较 (xs，n=20) Table 1 Comparison of pulmonary ventilation functionindexes of rats among groups对照组模型组治疗组表 4 各组大鼠血清超氧化物歧化酶和丙二醛水平 (xs)Table 4 Serum superoxide dismutase and malondialdehyde levels in rats项目对照组模型组治疗组_项目1 s 时间
27、用力呼出量(L)肺活量之比(%) 最大呼气中期流速(L/s)2.080.15 1.060.23b 1.730.23ab 超氧化物歧化酶(U/mL) 152.731.26 102.021.23a 141.621.22ab 丙二醛(mol/mL) 3.78 0.33 6.86 0.35a 4.02 0.32ab 表注：与模型组比较，aP 0.05；与对照组比较， bP 0.05。bab1 s 时间用力呼出量与用力 85.022.38 38.712.56 72.082.341.860.18 1.060.17 1.370.55 4.850.10 4.130.18b 4.380.14abbab最大呼气流
28、量(L/s)表注：与模型组比较，aP 0.05；与对照组比较， bP 0.05。表 2 各组大鼠白细胞总数、巨噬细胞数及中性粒细胞数变化_(xs) Table 2 The total number of white cells, the number of macrophages and the number of neutrophils in the white blood cells of rats in each group表 5 各组大鼠平均内衬间隔、单位面积平均肺泡数、平均肺_泡面积比较 (xs) Table 5 Mean lining interval, mean alveolar
29、 number per unit area, and the average alveolar area in rats组别平均内衬间隔 (m)对照组 模型组 治疗组45.052.11 80.562.13a 55.372.15ab平均肺泡数 (106 个 /m2) 406.3718.21 205.2812.27a 325.1512.18ab平均肺泡面积 (m2) 5 108.12330.21 8 134.20423.25a 5 982.37415.30ab项目-对照组 模型组 治疗组 3.950.55ab 1.960.28ab白细胞总数(109 L1) 2.500.57 6.420.68a 巨
30、噬细胞数(%)1.670.183.470.58a表注：与模型组比较，aP 0.05；与对照组比较， bP 0.05。中性粒细胞数(%) 7.871.20 25.122.13a 13.24 1.18ab 表注：与对照组比较，aP 0.05，与模型组比较， bP 0.05。表 3 各组大鼠血清白细胞介素 8、肿瘤坏死因子 、C-反应 蛋白水平比较 (xs) Table 3 Comparison of interleukin 8, tumor necrosis factor alpha and C-reactive protein levels in rat serum对照组 26.482.24 1
31、8.202.30模型组 57.062.23 78.012.27baa_项目白细胞介素 8(ng/L)肿瘤坏死因子 (g/L)治疗组 36.412.15 30.122.31abab图 1 CM-Dil 标记的脂肪间充质干细胞Figure 1 CM-Dil labeled adipose-derived mesenchymal stem cells图注：脂肪间充质干细胞能够归巢到慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织并存活。C-反应蛋白(ng/L) 1.93 0.78a25.722.76a 8.350.24ab表注：与模型组比较，P 0.05；与对照组比较，P 0.05。A B C图 2 各组大鼠肺组织病理变
32、化(苏木精-伊红染色)Figure 2 The pathological changes of lung tissues in rats (hematoxylin-eosin staining)图注：图中 A 为对照组肺组织结构完整(200)；B 为模型组肺组织可见到慢性阻塞性肺疾病样病理改变(40)；C 为治疗组肺气肿样改变减轻(100)。2.6 荧光显微镜下观察脂肪间充质干细胞的定位 CM-Dil 标记的脂肪间充质干细胞能够归巢到慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织并存活，见图1。2.7 大鼠肺组织病理变化 治疗组、模型组肺组织均6180可见到慢性阻塞性肺疾病样病理改变，但治疗组较模型组肺气肿样改变
33、减轻(图 2)，平均内衬间隔 (MLI)、单位面积平均肺泡数(MAN)、平均肺泡面积(MAA)差异均有显著性意义 (P 0.05)，见表 5。P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org慢性阻塞性肺疾病是一种慢性炎症性疾病14-15，其累及包括中央气道、外周气道、肺实质在内的组织。目前最主要治疗为早期戒烟16，积极预防气道感染17-18，早期有效地控制炎症反应19-21，长期家庭氧疗能改善患者低氧血症22，加强体育锻炼增强机体抵抗力23，防治并发症等24，传统的药物及相关外科治疗均不能阻止病情的进一步发展，作用非常有限25，几乎没有其他明确的方法能
34、够延长患者的寿命，也没有任何治疗方法能够完全恢复慢性阻塞性肺疾病患者受损的肺功能26-27。 骨髓间充质干细胞可以在特定条件下分化成为多种不同的组织器官被广泛应用于多种临床疾病的治疗28-30。相关研究证实脂肪组织中同样含有大量的间质干细胞，也具有体外增殖及多重分化的潜力，能运用于组织与器官的再生与修复31-33。目前有研究认为骨髓间充质干细胞移植后，在一定诱导条件下可以到达损伤的肺组织分化成肺泡上皮细胞34-37。实验对治疗组大鼠经尾静脉注射 CM-Dil 标记的脂肪间质干细胞，其余两组注射等剂量的生理盐水，研究结果显示脂肪间质干细胞能够归巢到大鼠的肺组织并且存活，与上述研究结果一致。除此之
35、外脂肪间质干细胞还可以通过分泌各种细胞因子减轻炎症反应、促进损伤组织的修复38-42，结果显示治疗组炎症因子高于对照组而低于模型组，提示脂肪间质干细胞移植有降低炎症反应的作用。综上所述，脂肪间质干细胞移植能改善慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织病理改变，减轻炎症反应，具有一定治疗作用。致谢：感谢天津市海河医院呼吸科的吴琦老师与天津市津南区咸水沽医院内科的王茂均老师。作者贡献：实验设计为郝术安、吴琦，实验实施为郝术安、吴琦、王茂均，实验评估为吴琦、王茂均，资料收集为郝术安、吴琦、王茂均。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：实验过程中对动物的处置符合 2009 年Ethical
36、 issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。文章查重：文章出版前已经过 CNKI 反剽窃文献检测系统进行 3 次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAHwww.CRTER.org合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库 )记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1
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