1、RNA 提取操作流程1 样品 RNA 的抽提取冻存已裂解的细胞，室温放置 5 分钟使其完全溶解。两相分离 每 1ml 的 TRIZOL 试剂裂解的样品中加入 0.2ml 的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体 15 秒后，15 到 30孵育 2 到 3 分钟。4下 12000rpm 离心15 分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA 全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的 TRIZOL 试剂的 60%。RNA 沉淀 将水相上层转移到一干净无 RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的 RNA，混匀后 15 到 30孵育 10 分钟后，于
2、4下 12000rpm 离心 10 分钟。此时离心前不可见的 RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。RNA 清洗 移去上清液，每 1mlTRIZOL 试剂裂解的样品中加入至少 1ml 的 75%乙醇（75%乙醇用 DEPCH2O 配制），清洗 RNA 沉淀。混匀后，4下 7000rpm 离心 5 分钟。RNA 干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使 RNA 沉淀在室温空气中干燥 5-10 分钟。溶解 RNA 沉淀 溶解 RNA 时，先加入无 RNA 酶的水 40l 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的 RNA 溶液保存于-80待用。2 RNA 质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的 TE
3、溶液将分光光度计调零。然后取少量 RNA 溶液用 TE 稀释（1:100）后，读取其在分光光度计 260nm 和 280nm 处的吸收值，测定 RNA 溶液 浓度和纯度。 浓度测定A260 下读值为 1 表示 40 ?g RNA/ml。样品 RNA 浓度(?g/ml)计算公式为：A260 稀释倍数 40 ?g/ml。具体计算如下：RNA 溶于 40 ?l DEPC 水中，取 5ul，1:100 稀释至 495?l 的 TE 中，测得 A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 100 40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l取 5ul 用来测量以后，剩余样品 RN
4、A 为 35 ?l，剩余 RNA 总量为：35 ?l 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g纯度检测RNA 溶液的 A260/A280 的比值即为 RNA 纯度，比值范围 1.8 到 2.1。2）变性琼脂糖凝胶电泳测定制胶1g 琼脂糖溶于 72ml 水中，冷却至 60，10 ml 的 10 MOPS 电泳缓冲液和 18 ml 的 37% 甲醛溶液(12.3 M)。10MOPS 电泳缓冲液浓度 成分0.4M MOPS，pH 7.00.1M 乙酸钠0.01M EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入 25 ?l 溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的 1MOPS 电泳缓冲液至覆盖
5、胶面几个毫米。准备 RNA 样品取 3?gRNA，加 3 倍体积的甲醛上样染液，加 EB 于甲醛上样染液中至终浓度为10?g/ml。加热至 70孵育 15 分钟使样品变性。电泳上样前凝胶须预电泳 5min，随后将样品加入上样孔。5-6V/cm 电压下 2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少 2-3cm。紫外透射光下观察并拍照28S 和 18S 核糖体 RNA 的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提 RNA 的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的 2 倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的 RNA（tRNA 和 5S 核糖体 RNA）组成。在 18S 和28S 核糖体带之间可以
6、看到一片弥散的 EB 染色物质，可能是由 mRNA 和其它异型 RNA 组成。RNA 制备过程中如果出现 DNA 污染，将会在 28S 核糖体 RNA 带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA 的降解表现为核糖体 RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3 样品 cDNA 合成反应体系序号 反应物 剂量1 逆转录 buffer 2l2 上游引物 0.2l3 下游引物 0.2l4 dNTP 0.1l5 逆转录酶 MMLV 0.5l6 DEPC 水 5l7 RNA 模版 2l8 总体积 10l轻弹管底将溶液混合，6000rpm 短暂离心。混合液在加入逆转录酶 MMLV 之前先 70干浴 3 分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶 0.5l，37水浴 60 分钟。取出后立即 95干浴 3 分钟，得到逆转录终溶液即为 cDNA 溶液，保存于-80待用。
