1、实验二 蛋白质的显色反应一、实验目的1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接形式。2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。二、呈色反应1、双缩脲反应（1）原理：尿素加热至 180oC 左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性条件下能与 Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应（二肽和氨基酸都不能发生双缩脲反应） 。可用于蛋白质的定性或定量测定。反应式如下：双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有，含有一个肽键和一个-CS-NH 2, -CH2-NH2, CNH2ONH2CNH
2、2ONH2180oCCCNHNH2NH2OO+ NH3双 缩 脲CCNH2NH2NHOO Cu2+OH+ NH CCO-ONHCu NHNHCONHCO-NH2紫 红 色 化 合 物 2-CHR-NH2, -CH2-NH2-CH-NH2-CH2-OH 或-CHOHCH 2NH2等基团的物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。NH3也干扰此反应，因为 NH3与 Cu2+可生成暗蓝色的络离子 Cu（NH 3） 42+。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。（2）试剂尿素，10%氢氧化钠溶液，1%硫酸铜溶液，2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液：水= 1：
3、9）（3）操作取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加 10%氢氧化钠溶液约 1mL，振荡混匀，再加 1%硫酸铜溶液1 滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。 （由于杂质以及氨气的干扰，导致颜色不都是紫红色）向另一试管加 2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液：水= 1：9）约 1mL 和 10%氢氧化钠溶液约2mL，摇匀，再加 1%硫酸铜溶液 2 滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。2、茚三酮反应(1) 原理蛋白质、多肽和各种氨基酸以及所有-氨基酸均能发生该反应 ，除无
4、-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色反应外，其它均生成蓝紫色化合物，最终生成蓝色化合物。氨、-丙氨酸和许多一级氨化合物都有此反应。尿素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质或氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮反应呈阳性反应的不一定都是蛋白质或氨基酸。该反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化脱氨形成酮酸，酮酸脱羧成醛，放出 CO2、NH 3，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有蓝色物质。反应机理如下： CC COHOH+ H2N CHCOOHROOCC COHH + NH3 + CO2 + R COHOO还 原 型 茚
5、三 酮3该反应非常灵敏，1：150 万浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。但在定性、定量测定中，一方面要严防干扰物存在，另一方面要在适宜的 PH 条件下进行测定。该反应的适宜的 PH 为 57，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同 pH 条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。（2）试剂蛋白质溶液：2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清：水=1：9） ，0.5%甘氨酸，0.1%茚三酮水溶液，0.1%茚三酮-乙醇溶液。（3）操作取两支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液 1mL，再各加 0.5mL0.1%茚三酮水溶液,混匀，在沸水浴中加热 12 分钟，观察颜色由粉色变紫色再变
6、蓝色（pH 不同颜色深浅不同） 。在一小块滤纸上滴一滴 0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴 0.1%茚三酮-乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。3、黄色反应（1）原理含有苯环的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。反应式如下CC COOHNCCCOO+ 3H2O蓝紫色HO + OHNO3 HONO2NaOHN O- Na+O硝 基 酚 （ 黄 色 ）邻 硝 醌 酸 钠 （ 橙 黄 色 ）CC COHH + NH3OO还 原 型 茚 三 酮+ CCCHOHOOO4多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以呈黄色反
7、应，苯丙氨酸不易硝化，须加入少量浓硫酸才有黄色反应。（2）试剂 鸡蛋清溶液（将新鲜鸡蛋清用 6 层纱布过滤，然后按鸡蛋清：水=1：20 配制而成。大豆提取液：将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状再用纱布过滤。 头发。指甲。 0.5%苯酚溶液。浓硝酸。0.3%色氨酸溶液。0.3%酪氨酸溶液。10%氢氧化钠溶液。（3）操作向 7 个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入 10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜 色变化（1 4 管可能需要加热） 。管号 1 2 3 4 5 6 7材料 鸡蛋清溶液 大豆提取液 指甲 头发 0.5%苯酚
8、0.3%色氨酸 0.3%酪氨酸浓硝酸 4 滴 4 滴 少许 少许 4 滴 4 滴 4 滴现象 1现象 24、考马斯亮蓝反应（1）原理考马斯亮蓝 G250（R250）具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。它染色灵敏度高，比氨基黑高 3 倍。反应速度快，约在 2 分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。在 0.01 1.0mg 蛋白质范围内，蛋白质浓度与 A595nm 值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。（2）试剂蛋白质溶液（鸡蛋清：水=1：20 配制而成） 。考马斯亮蓝溶液：考马斯亮蓝 G250100g 溶于 50mL95%乙醇中，加 100mL85%磷酸混匀，配成原液。临用前取原液 15mL，加蒸馏水至 100mL，用粗滤纸过滤后，最终浓度为 0.01%。（3）操作取两支试管，按下表操作5管号 试剂 蛋白质溶液（mL） 蒸馏水（mL） 考马斯亮蓝染液（mL）1 0 1 52 0.1 0.9 5结果分析：要分析结果，为什么出现这样的结果，什么原因导致的？实验报告不能用铅笔写。
