1、分子标记技术在植物线虫学的应用张卫东 1 廖力 1 蒋立琴 2 徐淼锋 1 陈其文 1（1. 珠海出入境检验检疫局 519015 2. 珠海市质量技术监督局 ）分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新型的遗传标记形式，它以核酸分子的突变为基础，是直接在DNA 分子上检测生物间的差异，是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异 13 。DNA 分子标记能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测，不受环境及基因表达与否的限制，具有多态性高，遗传稳定，检测手段简单、快速，检测结果客观准确等特点，可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的
2、许多缺陷和难题。因而，DNA分子标记技术自1974年Grodzicker创立RFLP技术以来，各种新型标记相继问世，并逐渐渗透到生命科学的各个领域。在植物检疫学科中，DNA分子标记技术已成功应用于植物病原真菌、细菌、昆虫和线虫等的研究中 48 。本文就分子标记在植物病原线虫学的应用作一综述。1 分子标记技术在植物线虫学的应用1.1 限制性片段长度多态性（Restriction fragment polymorphisms, RFLP ）限制性片段长度多态性（RFLP , restriction fragment length polymorphism）是最早发展起来的分子标记技术之一 9。其原
3、理是对特定的DNA 片段的限制性内切酶产物进行分析，根据片段的大小不同以及标记片段种类和数量的不同，从而分析在同源序列上产生的DNA 片段长度多态性差异。此技术及其从中发展起来的一些变型均包括以下基本步骤：DNA 的提取、用限制性内切酶酶切DNA、用凝胶电泳分开DNA 片段、把DNA 片段转移到滤膜上、利用放射性标记的探针显示特定的DNA 片段（通过Southern 杂交）和分析结果。二十世纪八九十年代，该方法在植物线虫学中应用较多。如1986年Curran首先用该技术成功区分了Trichinella和根结线虫（Meloidogyne） ； Burrows和Boffey 用该技术区分了马铃薯金
4、线虫（Globodera rostochiensis）及马铃薯白线虫（ G. pallida） ；Bolla等应用RFLP方法区分了松材线虫与拟松材线虫；Webster等构建了松材线虫的基因文库，从中筛选了来自rDNA的内切酶片段，并正确区分了不同来源的松材线虫与日本和欧洲的拟松材线虫 1013 。RFLP标记的具有重复性好、稳定性高和共显性遗传等特点。但是， RFLP 分析操作过程中涉及了DNA 的提取、酶切、电泳分离、探针的制备和Southern 杂交等一系列分子生物学技术，步骤繁杂，工作量大，而且对DNA的需求量很大，检测多态性频率较低，特别是放射性同位素及核酸杂交技术，既不安全又不易自
5、动化。因此很大程度上限制了该项技术的应用，已逐渐被其他新型标记所替代。1.2 随机扩增多态性（Random amplified polymorphism DNA ，RAPD） RAPD技术是由 Williams等(1990)发明的一种新的分子标记技术，基本原理是利用一系列不同的碱基随机排列的寡聚核苷酸单链作为引物对所研究的基因组DNA 进行PCR扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，EB 显色或放射性自显影来检测扩增DNA片段的多态性，这些扩增的DNA 片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性 14。RAPD 反应引物是随机排列的，无须专门设计，引物较短，可以在对物种没有任何
6、分子生物学研究的情况下，构建基因组的指纹图谱，通过统计分析为物种进化和分类提供DNA水平上的理论依据，对于种、亚种、变种的鉴别与演化关系的研究具有重要意义。Irdani 等（1995） 、Braasch 和 Burgermeister（1995） 、郑经武等（1998） 、汪来发等（2001）用 RAPD 技术成功的区分了松材线虫与拟松材线虫 1518 。此外张路平等（2002）对松材线虫与拟松材线虫的线粒体 DNA 进行了 RAPD分析，将松材线虫的群体分成日本株系与北美洲株系 19。Amiri 等（2003）应用 RAPD 技术构建了区分甜菜胞囊线虫（H. schachtii）和 H. b
7、etae 的图谱 20；Carneiro 等（2004）利用 RAPD 技术对来自巴西、美国咖啡上的根结线虫进行遗传学变异分析 21；Lax 等（2004）首次对来自阿根廷的大豆胞囊线虫（Heterodera glycines）进行了 RAPD 分析，指出两群体间存在明显的遗传学差异，并分析可能是由于基因漂移或不同管理措施所造成的结果 22。此外，RAPD 标记成功应用于鳞球茎线虫（Ditylenchus dipsaci） 、马铃薯金线虫与白线虫等 2324 。RAPD 技术是一种优于 RFLP 技术的DNA分子标记方法，具有效率高、样品用量少、灵敏度高、成本较低和检测容易等优点。但是RAPD
8、 技术也存在一些不足，实验的稳定性和重复性差。首先是显性遗传，不能识别杂合子位点，这使得遗传分析相对复杂，在基因定位、作连锁遗传图时，会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降；其次，RAPD 对反应条件相当敏感，无论是模板质量和浓度，单一短引物序列，非特异性扩增，基因组DNA 的复杂性，技术设备等都是导致RAPD 技术重复性差的原因。1.3 序列特异性扩增区域 (Sequence characterized amplified regions , SCAR)Paran 和 Micrhlmore（1993）首次提出 SCAR 标记，该标记是在 RAPD 标记的基础上发展的 25。基本步
9、骤：先做 RAPD 分析，然后将 RAPD 标记片段从凝胶上回收并进行克降和测序，根据 RAPD 片段的两末端序列设计一对特异引物(一般 18-24bps 左右) ，对基因组 DNA 进行 PCR 扩增，筛选鉴定对应 RAPD片段的单一位点。该标记由于所用引物较长及引物序列和模板 DNA 完全互补，因此可在严格条件下扩增，结果稳定性好，可重复性强，比较属内种间差异能力更强，在基因定位和做图在的应用前景广泛。Zijlstra 等利用 SCAR 标记成功鉴定了南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫，而且结果显示所获得的标记能特异性鉴定根结线虫生活史各龄期 2627 。1.4 扩增片段长度多态性(
10、Amplified fragment length polymorphism , AFLP)扩增片段长度多态性( AFLP) 是基于RAPD和RFLP 相结合的一种DNA 指纹技术。其原理是利用限制性内切酶消化基因组DNA 产生不同大小的DNA 片段再进行选择性扩增，使用双链人工接头与基因组DNA 的酶切片段相连接作为扩增反应的模板DNA，用含有选择性碱基的引物对模板DNA 基因选择性扩增，获得的DNA 扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。既具有RFLP标记的专一性、可靠性，又具有RAPD标记的随机性、方便性。由于该标记是通过选用不同的内切酶达到选择性扩增的目的，因此又被称作选择性限制
11、片段扩增标记（ Selective restriction fragment amplification, SRFA） ，AFLP是目前在种群遗传多样性研究中应用较广的分子标记技术 28。Folkertsma 等（1996）用AFLP方法对2种马铃薯胞囊线虫的24个群体的遗传多样性进行了分析，可明显将马铃薯金线虫分为3个不同的致病型 29。Samblat 等对3种根结线虫的15个群体的遗传多样性进行了AFLP 研究，结果表明种间遗传差异显著，种内遗传变异不同，花生根结线虫的遗传多态性最丰富 30。Kaplan 等 （1999）利用AFLP标记能探测到甜菜胞囊线虫（H. schachtii ）种
12、内群体基因的变异 31。 Marche 等（2001）对来自美国和墨西哥的烟草胞囊线虫进行了AFLP分析，明确指出两者属于烟草胞囊线虫的不同亚组 32。AFLP 技术与其它的DNA 指纹技术相比具有效率高、重复性好、多态性强分辨率高以及不受基因组遗传背景信息局限等优点。其缺点主要是AFLP是一项专利技术，受专利权保护，实验成分和造价费用昂贵；对基因组的复杂性认知程度有限，内切酶的选择具有盲目性；对DNA纯度和内切酶的质量要求较高，操作技术难度大等方面。但随着AFLP操作步骤的简单化、规范化和自动化，其分析效率会进一步提高，应用范围会不断扩大。1.6 简单重复序列 (Simple sequenc
13、e repeat , SSR) SSR 也称微卫星（Microsatellite） ，是一种由 2-5 个核苷酸为重复单位串联组成的长达几十个核苷酸的序列，其广泛分布于整个真核生物基因组的不同座位上，具有重复性好、多态性高、实验程序简单和对模板 DNA 的要求低（几百个碱基对就可用作模板 DNA）等特点 33。SSR 标记的基本原理：根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物，通过 PCR 反应扩增微卫星片段。由于核心序列重复数目不同，因而扩增出不同长度的 PCR 产物，这是检测 DNA 多态性的一种有效方法。目前已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠、水稻、小麦、玉米等物种的染色体遗传图谱，
14、这些微卫星标记已被广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种鉴定、农作物育种、进化研究等领域 34。Thiery 和 Mugniery（2000）首次将微卫星分离技术应用到植物寄生线虫上，对马铃薯白线虫的基因库进行了分析，获得含有效微卫星重复子的克隆，并以此设计特异性引物，对不同的马铃薯白线虫群体及球形胞囊线虫属的部分线虫进行了检测 35； 2003 年 He 等获得了来自标准剑线虫（Xiphinema index）7 个不同的含微卫星重复子的 DNA 分子标记片段，除微卫星标记 XIMSLI 外，其它标记均可用于标准剑线虫的诊断和种内群体遗传多态性的分析 36。SSR 是目前较好的遗
15、传标记之一，具有重复性好、多态性高、实验程序简单和对模板 DNA 的要求低等特点，但获得 SSR 标记一般需要建立、筛选基因组文库，克隆测序，引物设计等一系列实验，特别是依赖测序设计引物，成本较高。而且，SSR 标记中所用引物不同，实验结果差异较大。但随着微卫星研究的深入，新的序列大量涌入 GeneBank 中，SSR 标记必定会在 DNA 多态性领域发挥更重要的作用。2 问题与展望分子标记技术作为一种新型的分子生物学技术，已经广泛的应用于植物寄生线虫基因定位、疾病诊断、遗传变异、品种鉴定以及亲缘进化关系等相关领域。分子标记技术由于不受线虫发育阶段、环境条件以及虫量的限制，只用单条线虫就可以将
16、其鉴定到种或种以下的水平，解决形态学上不能解决的分类鉴定中的难题。特别是以其快速、准确、微量、灵敏度高、程序简单等优点广泛应用于植物检疫检测中，是目前线虫学中发展较快的一种鉴定手段。然而DNA分子标记技术运用于植物病原线虫学中的研究仅有10余年的时间，从实验研究技术到数据处理分析都有着很多不完善的地方。如何把传统的形态标记、细胞标记和生化标记研究方法与现代分子标记技术有机的结合起来是一个关键的问题；如何从病原线虫复杂的基因组中选择有效的、具有丰富遗传信息的并能够真实反映遗传关系的分子标记，也是一个很大的难题；如何建立广泛认可的分子标记研究技术是研究者们所面临的难题。DNA 分子标记从它诞生之日
17、起，就引起了生物科学家极大的兴趣，在经历了短短几十年的迅猛发展后，分子标记技术日趋成熟。以分子杂交为基础的标记由于具有放射性而逐渐被操作性好、稳定性强的以PCR为基础的分子标记所取代。随着分子生物学理论与技术的迅猛发展，必将不断地开发出诊断速度更快、成本更低、信息量更大的分子标记，而分子标记技术与DNA 提取程序化、电泳胶片分析自动化、信息处理智能化的结合，必将加速其在病原线虫遗传图谱的构建、基因的定位、生物多样性分析、物种亲缘关系鉴定及与相关致病基因的诊断等各个领域的进一步研究。参考文献1. 周延清. DNA 分子标记技术在植物研究中的应用M. 北京: 化学工业出版社,2005,56- 57
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