1、病理学常用研究方法,一、免疫组化标准化问题探讨,本世纪70年代问世 抗体种类急速增加，交叉反应存在 免疫组化技术方法不断问世 使用的试剂或实验室条件不同 操作人员的熟练程度 病理医生的结果判定水平及关联知识 解决标准化的问题势在必行,(一)方法的选择,目前常用的免疫组化方法有： PAP、ABC、APAAP法、S-P方法等 各种方法只要运用得好，都会得到满意 的结果建议：在我们省内都采用S-P法,S-P法的优点 方法统一 有配套的即用型抗体、试剂盒和显色试剂盒 一般2-3小时(30-60)，而ABC法需1天，分子量小(60KD)，穿透力强 灵敏性高，特异性强，4个亚基都能于二抗上的生物素结合，而
2、且结合键强 背景低，非特异性反应少，等电点为6.5，接近于中性，不与内源性凝集素样物质结合,而ABC法为10,S-P法与ABC法的区别,S-P法：Streptaridin peroxidase conjugataed method 链霉菌素抗生物素蛋白过氧化物酶连接法 ABC法： Avidin-Biotin peroxidase complex method 卵白素亲生物素过氧化酶复合物法,S-P法中的链霉菌素抗生物素蛋白取代了ABC方法中的卵白 素和生物素 即：卵白素中的4个亚基一方面与第二抗体上的生物素结合，另一方面还与复合物中的生物素结合,ABC法：,S-P法：,(二) 固定、包埋,固定
3、液：一般10%中性缓冲福尔马林，PH7.3-7.4(PBS配制) 固定时间：应少于24小时，固定时间越长，抗原丢失越多 固定液量或组织块大小：组织为1/3，固定液2/3 大体标本：切下一块固定,包埋：起初免疫组化对蜡温的要求很严，温度一高会严重影响结果。现在由于抗体质量的提高，以及抗原恢复方法的问世，多数人又忽视了蜡温的问题。个人认为：尽管有抗原修复方法，但不如开始就不使抗原破坏，另外，蜡温过高，组织变脆，不易切成大片，容易脱片。因此，要控制蜡温在65以下,(三) 抗原修复(抗原暴露、抗原复原),组织中存在某种抗原、但用特异性抗体，却为阴性 其原因是： 固定、包埋后部分抗原决定簇与核酸或其它蛋
4、白抗原发生了交联，形成网络 固定液中的醛基本身也会发生交联，而封闭抗原,抗原修复的目的：就是要打开交联，暴露抗原决定簇，有利于抗原抗体反应，抗原修复的方法从大的方面讲有两种：,热修复：0.01M柠檬酸缓冲液，PH=6.0，95，10分钟 注意：脱片多多聚L赖氨酸干片选医用微波炉 酶消化：1.细胞内抗原0.1%胰蛋白酶 20372.间质抗原4%胃蛋白酶37，4-8小时,(八)免疫组织化学的发展,1. 免疫PCR：主要用于临床生物分子检测方面血清(Ag)电泳+Ab+无关引物扩增显色意义：1. 原来较弱、水平较低的酶等，用免疫PCR就可以检测出来2. 需要较长或一定时间才能查出来 用免疫PCR法，就
5、可提前查出来 如：病毒性心肌炎、血肿CPK检测 心梗早期心肌酶谱的检测等,心梗预报：心绞痛一般认为没有酶 谱改变，设想用免疫PCR就可能发现改变,2. 原位免疫PCR在组织切片上有定位Ag+Ab1+Ab2卵白素洗净生物素标记的DNA片断洗净原位PCR扩增洗净ACB或S-P显色特点：提高阳性率定位好,2. 扩增：,Total: 25l PCR buffer 2.5l mixed dNTP 2.0l dH2O 16.375l primer 1 1.0lprimer 2 1.0l Taq 0.125l DNA template 2.0l 94 25” 55 25” 72 40” 30 cycles,
6、3. Agarose 2-5%，用1TBE电泳扩增后液 5l + 1l loading buffer溴化乙淀染色 20，UV照射下确认泳带照相,4. DNA收集RECOCHIP法,三、Western Blotting,1. 提取蛋白500l的hypotonic buffer + 组织2mm3匀浆器粉碎 冰上放置3015000转/分，4，30。 上清：细胞质蛋白，+250l 3loading buffer 沉淀物 + 750l loading buffer 再次粉碎、离心，上清为细胞膜蛋白2-氢硫基乙醇 7.5l(1/100)混合95沸腾5分钟 冰上放置,2. 蛋白定量标准蛋白浓度制备：BSA，
7、0，0.5，1，2mg/ml比色：测定系数换算成含量 计算出每个样品加样量 3. 电泳丙烯酰胺 上部胶、下部胶 marker样品 4. 转膜 5. 洗膜 一抗、二抗 显色或自显影,四、组织芯片(Tissue Micro-Array, TMA),组织芯片技术是一种特殊生物芯片技术，它是将几十个或几百个不同个体的临床组织标本按预先设计的顺序排列在一张玻片进行分析研究，是一种高通量、多样本的分析工具。它使科研人员第一次有可能同时对几百甚至上千种正常或疾病以及疾病发展不同阶段的自然病理生理状态下的组织样本，进行某一个或多个特定的基因，或与其相关的表达产物的研究。,应用 免疫组化 DNA或RNA原位杂交 FISH 原位PCR,低密度芯片(50-70个标本)、高密度芯片(500个标本),制作过程,1. 组织处理：固定、石蜡包埋、HE染色、组织定位 2. 组织打孔/阵列仪钻取组织，直径0.6mm 3. 制作阵列蜡块，将钻取的组织按设定的位置放入空白蜡块内 4. 切片厚度为5m，以40为宜，56烤片3小时，备用,好的组织芯片 1. 制片过程中组织片不移位、不脱落 2. 组织样本的厚度以3mm为佳 3. 每张组织芯片为5m 4. 一个芯片蜡块可切片100-200张 注：0.6mm组织片上约有30,000个细胞，2mm的组织芯片约有100,000个细胞,
