1、钙强化食品中维生素 D 测定方法的研究462 中国卫生检验杂志 2005 年 4 月第 15 卷第 4 期ChineseJournalofHealthLaboratoryTechno1ogY,Apr2005;Vo115No4【测定方法】钙强化食品中维生素 D 测定方法的研究赵榕,薛颖,吴国华,王莉莉(北京市疾病预防控制中心,北京 100013)中图分类号R155.5文献标识码A 文章编号10048685(2005)04046202目前市场上复合型的强化食品很多.为促进钙的吸收,常在补钙食品中添加维生素 D.随着科学技术的进步 ,添加到强化食品中的维生素 D 不再局限于普通型的原料, 多数使用了
2、经过包被的维生素 D,以进一步提高维生素的抗氧化性能 .然而这一技术的改进,给检测工作带来了很大的难度.按药典中直接提取的方法,无法对样品中的维生素 D 进行完全提取,而采用先皂化后提取方法,虽可以部分解决“破包被“ 的问题,但操作繁琐,重现性较差.为解决这一难题,本文对钙强化食品中维生素 D 的测定方法进行了研究.1 材料与方法1.1 仪器与试剂1.1.1 仪器 Waters 一 2695 高效液相色谱仪,配备有 WatersAllains2695 泵控系统,以及 Waters 一 2996 二极管阵列检测器.1.1.2 试剂乙醇,色谱纯(迪马公司);乙腈,色谱纯(迪马公司);正己烷,色谱纯
3、( 迪马公司 );二甲基亚砜(DMSO),分析纯;柠檬酸,分析纯;维生素 D 维生素 D:标准品,ChemService 公司;试验用水均为超纯水 ;高纯氮.维生素 D 标准储备液的配制:准确称取 0.0100g 维生素 D 标准品于 10nll棕色容量瓶中,用乙醇溶解并定容至体积.维生素 D:标准储备液的配制:准确称取 0.0100g 维生素 D 标准品于 10nll 棕色容量瓶中,用乙醇溶解并定容至体积.破壁液的配制:5%柠檬酸溶液+DMSO( 二甲基亚砜)=20+80.标准系列的配制:将维生素 D 和维生素 D:标准溶液在使用前用紫外分光光度法根据吸光系数 E 标定含量.以维生素 D:为
4、内标 ,浓度为 20nll,配制维生素 D 标准系列,浓度分别为 2.0,5,0,10,0,15.0,20.0g,/ml.1.2 液相色谱条件色谱柱:ShishidoSuperiorexODS2504.6mnl;流动相 :乙腈;波长:264rim;流速:1.5ml/min;柱温:4o;进样体积:20uJ.1.3 样品处理用高速样品粉碎机将样品粉碎完全,混合均匀.准确称取 3,0g 于小三角瓶中,准确加入质量浓度为 100g,/ml 维生素 D:内标溶液 0,2ml(相当于 20g),加入 10nll 破壁液,振摇 10min 后,加入 20,0ml 正己烷,继续振摇 45min,将正己烷层小心
5、转移至离心管中,3000r/min 离心 3min,取上清液.向沉淀中加入 20.0ml 正己烷,再次提取,离心,合并上清液,混合均匀后,准确取 20,0ml,以氮气吹干,以 0,5nll 甲醇作者简介 赵榕 (1969 一),女,大学本科,主管检验师,主要从事食品检验工作.溶解,供 HPLC 测定.1.4 定性及定量分别取标准和样品各 20 进样,HPLC 测定.以标准中维生素 D,维生素 D:的峰面积之比与维生素 D 浓度关系绘制标准曲线.保留时间定性,内标法定量.C-C 一样品中的含量,me,/100g;c 一维生素 D 的测定浓度,g,/ml;w 一样品重量,g2 结果与讨论2.1 内
6、标物的选择维生素 D 是一组甾醇衍生物,包括麦角钙化甾醇(D:),胆钙化甾醇(D), 麦角固醇和 7 一脱羟基胆固醇.后两者分别是的前体,不会用于钙强化食品的添加.同时由于维生素 D:和具有相同的活性和化学性质,因此为了使维生素 D 的定量测定更准确,本方法确定:当测定维生素 D 时,以维生素 D:作为内标;当测定维生素 D:时,以维生素 D 作为内标.2.2 液相色谱条件的优化由于维生素 D:和维生素 D 具有相同的化学性质,使用一般的色谱柱不能很好地将其分离,因此本方法使用了 ShishidoSuperiorexODS2504.6laln 色谱柱.同时分别对甲醇 ,甲醇+水以及乙腈三种流动
7、相体系进行了试验,甲醇和甲醇+水作为流动相时,两组分可以很好的分离但保留时间过长.因此本方法确定了流动相为乙腈,流速为 1,5ml/min,维生素 D:和维生素 D 的保留时间分别为 10min 和 10.5min(见图 1 和图 2).248.0010121416l8时(1in)图 1 标准中维生素 D3,维生素 D2 色谱图及扫描光谱图占46.008_伽 l0l214时目(220240002 柏拍 0o.O30JO0r 皿 ,图 2 样品中维生素 D3,维生素 D2 色谱图及扫描光谱图中国卫生检验杂志 2005 年 4 月第 15 卷第 4 期ChineseJournalofHealthL
8、aboratoryTechn010gY,Apr2005;V0115No44632.3 样品制备方法的优化样品提取溶液的选择:维生素 D 为脂溶性维生素,根据其化学性质,分别对三氯甲烷,二氯甲烷和正己烷 3 种提取溶液的提取效果进行了试验.于含有维生素 D 样品中加入上述 3种提取液各 15rIll,振荡提取 20min,离心,取上清液 10.0ml,以氮气吹干,用甲醇定容后上机测定.结果表明:3 种提取溶液的提取效果相近.但是用三氯甲烷,二氯甲烷作为提取溶液,无法得到澄清的上清液,且毒性较大,因此,本方法选择了正己烷作为提取液.破壁液的选择:目前,多数钙强化食品中添加的维生素 D经过了包被处理
9、,直接提取效果往往不好.而样品经过皂化处理后再提取,虽然回收率可达到 60%87%,但重现性很差,也不适用于此类样品处理.为此,本文选择了二甲基亚砜(DMSO)作为破壁液的基础溶液,并对 4 种破壁液:水+DMSO(10+90),5g 柠檬酸 +20rIll 水+80mlDMSO,5g 没食子酸+20rIll 水+80rIllDMS0,5g 维生素 C+20rIll 水+80rIllDMSO 进行了试验 ,结果表明:破壁液 5g 柠檬酸+20rnJ 水+80mlDMSO 的破壁鲜果最好(见表 1).表 1 不同处理体系对测定结果的影响2.4 稳定性实验由于维生素 D 的化学性质不稳定,因此我们
10、将同一样品提取液放置于室温下,连续 3d 对其进行测定,结果见表 2.3d 内,维生素 D 的峰面积无明显变化,因此处理好的维生素D 样品在 12d 内上机测定应对检测结果无影响.表 2 稳定性实验2.5 检出限,精密度,回收率及线性范围在最佳色谱分离条件下,维生素 D 在 0100g/ml 范围内成线性,回归方程为:Y=5.68X 一 1.54,r=0.99989.定性检出限为 0.003ms/100g,定量检出限为 0.007ms/100g.精密度试验:对同一样品进行了连续 7 次测定,结果分别为 11.7,12.5,11.9,11.4,11.6,11.5,11.2s/ml,方法的精密度为
11、 3.7%.回收率试验:用配方中只含有碳酸钙及辅料的样品作本底,加入维生素 D,以及内标维生素 D,使得上机溶液中维生素 D3 的浓度为 10,50g/rIll,内标维生素 D 的浓度为20g/rIll,进行加标试验,回收率分别为:85%92%,98%102%参考文献1吴红京,唐根源 .反相高效液相色谱法测定补钙保健品中的维生素 D3J.色谱,1998,16(3):274 275.2吴怀春,程华 ,田嘉荣,等.高效液相色谱法测定强化奶及食品中维生素 D 含量J.色谱,1997,15(1):43 45.3GB/T5413.91997.婴幼儿配方食品和乳粉维生素 A,D,E 的测定s.(收稿日期:
12、20041226)(上接第 461 页)2.4 样品测定对 2002 年江苏地区采集的花生 18 份,玉米 30 份样品用此方法进行分析(见图 1,图 2),分析结果(见表 2)表明江苏地区花生和玉米均有轻度污染,均未超过现有国家标准(花生20.0g/kg,玉米20.0g/kg).但有 7 份样品 AFB.含量在 0.22.54kg 之间,其中 1 份花生样品检出 AFB.结果为 2.54kg,超出欧盟标准(AFB.2.0kg).表 22003 年江苏地区花生和玉米中 AFBl 调查结果图 l 玉米中 AFBl 的色谱图图2 花生中 AFBl 的色谱图参考文献1张洪祥,王兴国 ,赵瑞生,等编译.卫生试验法? 注解M. 北京华文出版社,1995.9.2GB/T5009.221996.食品中 AFB1 的测定方法S.(收稿日期:20041127)
