1、第 6 课时 土壤中分解尿素细菌的分离与计数目标导航 1.研究培养基对微生物的选择作用。2.进行微生物数量的测定。一、研究思路1筛选菌株(1)实验室中微生物筛选的原理人为提供有利于_生长的条件(包括营养、温度、pH 等)，同时_或_其他微生物生长。(2)选择培养基在微生物学中，将允许_种类的微生物生长，同时_或_其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。(3)分离分解尿素的细菌的选择培养基在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是_，提供氮源的是_，琼脂的作用是凝固剂。该培养基对微生物具有选择作用。其选择机制是_才能在该培养基上生长。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们体内能合成_，将
2、尿素分解的反应式是_。Taq 细菌能忍受 93左右的高温，是在美国黄石国家公园的一个热泉中发现的，这说明，在寻找目的菌株时，要根据_ _。2统计菌落数目的方法(1)稀释涂布平板法(也叫活菌计数法 )原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的_，通过统计平板上的_，就能推测出样品中大约含有多少活菌。操作第一，设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列 10 倍稀释，然后选择_稀释度的菌液，分别取 0.1 mL 接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布整个平板表面，放在适宜的温度下培养并计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度涂布到三
3、个或三个以上的平板上，培养并计算出_ _。第二，为了保证结果准确，一般选择菌落数在_的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。计算公式：每克样品中的菌株数 M，其中 C 代表CV_，V 代表_(mL) ，M 代表_。(2)显微镜直接计数法原理：此法利用特定的_或_，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积 1 mm2 和高 0.1 mm 的计数室，在 1 mm2 的面积里又被划分成 25 个(或 16 个)中格，每个中格进一步划分成 16 个(或 25 个) 小格，计数室由 _个小格组成。操
4、作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数 45 个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。计数公式：每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数40010 000稀释倍数。(3)设置重复和对照设置重复：培养过程中应设置重复组，同一稀释度下应涂布_个平板，才能增强实验的说服力与准确性。设置对照：实验中应设置对照，主要目的是_ _对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。如_对照组，观察培养物中是否有杂菌污染；设置_培养基，观察选择培养基是否具有_作用。二、实验设计实验步骤1土壤取样：从肥沃、湿润的土 壤中，用无菌小铁铲铲去表层土 3 cm
5、左右，迅速取土壤并装入_密封或事先准备好的_中。2制备培养基：制备_培养基作为对照组，尿素为唯一氮源的培养基作为_，用来判断选择培养基是否具有_。放宽稀释范围，如稀释倍数为 10310 7 范围内的要分别涂布，而每个稀释度下需要_个选择培养基、_个牛肉膏蛋白胨培养基，因此需要 15 个选择培养基和 5 个牛肉膏蛋白胨培养基。两种培养基应各有一个作为_对照，此外还需准备 8 个灭菌的试管和 1 个灭菌的移液管。3样品的稀释与涂布平板：参考下面的实验流程示意图，将 10 g 土样加入盛有 90 mL 无菌生理盐水的锥形瓶中 (锥形瓶体积为 250 mL)，充分摇匀，吸取上清液 1 mL，转移至盛有
6、_ mL 生理盐水的无菌大试管依次等比稀释至 107 稀释度，并按照由10710 3 稀释度的顺序分别吸取_mL 进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。说明：图中的 1、2、3 平板是_，4 为_作对照，判断选择培养基是否具筛选作用，还有两个空白对照，即不涂布稀释后菌液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，验证培养基中是否_。4将涂布好的培养皿放在 30温度下培养，及时观察和记录。5挑选选择培养基上不同形态的菌落接入含_培养基的斜面中，观察能否产生颜色反应。6细菌的计数当菌落数目稳定时，选取菌落数在_的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对 3 个平板进行重复计数，然后求
7、出_，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。同时仔细观察所分离到的菌落，并记录菌落特征。7统计表格表一 平板上的菌落数记录表稀释倍数 103 104 105 106 1071 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4123表二 菌落特征记录表菌落 形状 大小 隆起 颜色 种类 程度123注：一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间) ，_表现出_的菌落特征。三、操作提示1取土样用 的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要_。2应在_旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入_中，塞好棉塞。3在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在_旁操作。4实验
8、时要对_做好标记。注明_等。5为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当_。四、结果分 析与评价内容 结论分析有无杂菌污染的判断对照的培养皿中_菌落生长未被杂菌污染培养物中菌落数_被杂菌污染菌落形态多样，菌落数偏高培养物中混入_选择培养基的筛选作用牛肉膏蛋白 胨培养基的菌落数目_选择培养基的数目选择培养基具筛选作用，已筛选出一些菌落样品的稀释操作 得到 2 个或 2 个以上菌落数目在_的平板操作成功，能进行菌落的计数重复组的结果 若选取同一种土样，统计结果应_；如果结果相差太远，说明实验操作过程中出现操作失误，需要找出产生差异的原因五、课题延伸在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的_将尿素分解成
9、了_。氨会使培养基的碱性增强，_升高。因此，我们可以通过检测培养基_来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入_指示剂，培养某种细菌后，如果 pH 升高，指示剂将_，这样，我们就可以准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。知识点一 研究思路1下表为本课题使用的培养基，分析培养基配方，回答下面的问题。KH2PO4 1.4 gNa2HPO4 2.1 gMgSO47H2O 0.2 g葡萄糖 10.0 g尿素 1.0 g琼脂 15.0 g用蒸馏水定容到 1 000 mL(1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是_。(2)按物理性质划分该培养基属于_培养基，理由是培养基中含有
10、_；该类培养基常用于微生物的_等。(3)由于_，所以该培养基只能用于能够合成_的微生物的培养。用此培养基培养土壤浸出液能够从土壤中筛选出_的细菌。(4)在微生物学中，将_的培养基，称作选择培养基。2广东省是我国甘蔗生产区之一。甘蔗是一种高光效 的 C4 植物，单位面积产量很高，种植面积日益扩大，目前已成为南方地区燃料酒精生产的重要原料。利用甘蔗生产燃料酒精的一般工艺流程为：甘蔗榨汁(蔗糖) 酵母发酵蒸馏 成品(燃料酒精)。(1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：步骤 1：野生菌液体培养一段时间后接受
11、紫外线照射诱变处理。步骤 2：制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意_和_，加琼脂后灭菌，制成固体平板。步骤 3：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。步骤 4：根据_，筛选出突变菌。(2)上述步骤 2、3 和 4 的依据分别是_。知识点二 实验设计3用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为 106 的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的 是( )A涂布了 1 个平板，统计的菌落数是 230B涂布了 2 个平板，统计的菌落数是 215 和 260，取平均值 238C涂布了 3 个平板，统计的菌落数分别是 21、212 和 256，取平均值 163D涂布了 3 个平板，统计
12、的菌落数分别是 210、240 和 250，取平均值 2334在本实验操作中对使用的平板和试管要进行标记，以下说法正确的是( )A对培养皿仅需注明 培养基的种类即可B一般在使用之后进行标记C由于试管用的较多，只需对试管进行标记即可D标记的目的主要是为了防止实验中平板、试管等的混淆一、选择题1在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放 线菌的生长；在培养基中加入 10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出( )A乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌B固氮细菌、大肠杆菌、放线菌C固氮细菌、霉菌、放线菌D固氮细菌、金黄色葡萄
13、球菌、放线菌2请选出下列正确的操作步骤( )土壤取样 称取 10 g 土壤，取出加入盛有 90 mL 无菌水的锥形瓶中 吸取 0.1 mL 土壤溶液进行平板涂布 依次稀释至 101、10 2、10 3、10 4、10 5、10 6、10 7 稀释度ABCD3在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是( )A筛选出能分解尿素的细菌B对分离的菌种作进一步鉴定C作细菌的营养成分D如指示剂变蓝就能准确地认定该菌能分解尿素4下面对“从土壤中分离分解尿素的细菌过程中灭菌”的理解，不正确的是( )A防止杂菌污染B消灭全部微生物C稀释土壤溶液的过程中必须在火焰旁操作D灭菌必须在接种前进行5下列不属于菌
14、种记数方法的是( )A平板划线法 B稀释涂布平板法C显微镜检法 D滤膜法6下列有关配制培养基的叙述中，正确的是( )A制作固体培养基必须加入琼脂B加入青霉素可得到乳酸菌C培养自生固氮菌不需要氮源D发酵工程一般用固体培养基7用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。在某稀释浓度下某同学做了若干个平板并统计每个平板的菌落数，最接近样品中菌体数真实值的是( )A菌落数最多的平板B菌落数量最少的平板C菌落数量适中的平板D取若干个平板菌落数量的平均值8土壤中分解尿素的微生物所需氮源为( )A硝酸 B氨 C尿素 D蛋白胨二、简答题9在现代农业中，常在饲料中加入一定量的尿素去饲养牛等牲畜。因其有特殊的器官瘤胃
15、，在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物以尿素作唯一氮源。某一同学设计了如下实验，对能分解尿素的细菌进行分离和计数。.取样：到屠宰场，在刚宰杀的牛的瘤胃中取样，将样品装入事先准备好的信封中密封。.制备培养基：制备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数应明显多于选择培养基上的数目。由于初次实验，选择了一个较宽的稀释范围，并且每个稀释度下需要 3 个选择培养基，1 个牛肉膏蛋白胨培养基。.微生物的培养与观察：按稀释度的顺序分别吸取 0.1 mL进行平板涂布操作。将涂布好的培养皿放在 30下培养，并且需要无氧条件。比较两种培养基中菌落的数量、形态等
16、，并做好记录。挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红指示剂的培养基中，观察是否产生颜色反应。.细菌的计数：当菌落数目稳定时，选取平板计数。请回答下列问题：(1)制备牛肉膏蛋白胨培养基的目的是什么？_ _。(2)为什么每个稀释度下需要 3 个选择培养基？_。(3)上述培养时，为什么需要无氧条件？_。(4)应用含酚红指示剂的培养基的目的是什么？结果会呈现出什么样的颜色反应？原理是什么？_。(5)计数时应选什么样的平板进行计数？怎样计算出样品中的细菌数目？_。10有人送来一支芽孢杆菌菌种，其中一部分芽孢杆菌有抗青霉素的能力，另一部分没有抗性。请你把对青霉素有抗性的芽孢杆菌分离出来。(1)现有条件：
17、无菌牛肉膏培养基两个、无菌接种台、接种工具齐备、医用青霉素两支。(2)实验过程取两个培养基，分 别标号为 A、B，向 A、B 两个培养基中分别加入_，加入过程一定要进行_操作。向 A 培养基中接种_ _。接种后，将 A 培养基放入恒温箱培养两天。从_中挑取生长良好的芽孢杆菌，接种到 B 培养基中。接种后，将 B 培养基放入恒温箱内培养两天，即可获得较多抗青霉素芽孢杆菌。第两个步骤的目的是_。第 6 课时 土壤中分解尿素细菌的分离与计数知识清单一、1.(1)目的菌株 抑制 阻止 (2)特定 抑制 阻止(3)葡萄糖 尿素 只有能够以尿素作为氮源的微生物 脲酶 CO(NH 2)2H 2OCO22NH
18、 3 它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找 脲 酶 2(1)一个活菌 菌落数 三个 菌落平均数 30 300 某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 涂布平板时所用 的 稀释液的体积 稀释倍数 (2)细菌计数板 血细胞计数板 400 (3) 至少 3 排除实验组中非测试因素 空白 完全 筛选二、1.(1)无菌信封 烧杯 (2)牛肉膏蛋白胨 实验组选择作用 3 1 空白 (3)9 0.1 选择培养基牛肉膏蛋白胨培养基 含有杂菌 (5)酚红指示剂 (6)30300 平均值 (7)同种微生物 稳定三、1.灭菌 2.火焰 锥形瓶 3.火焰 4.培养皿 培养基类型、培养时间、稀释度、培养物 5.事先规划
19、时间四、无 偏高 其他氮源 大于 30300 接近五、脲酶 氨 pH pH 的变化 酚红 变红对点训练1(1)葡萄糖和尿素 (2) 固体 琼脂 纯化、分离、计数 (3)培养基中只有尿素一种氮源 脲酶 分解尿素 (4)允许特定种类的微生物生长，并能抑制或阻止其他种类微生物生长解析 根据培养基的成分，可以推断培养基的类型以及适于培养的微生物的代谢类型。含有琼脂、明胶等凝固剂的培养基为固体培养基；不含凝固剂的为液体培养基。不含碳源的培养基适于自养微生物的培养，不含氮源的培养基适于固氮微生物的培养等。固体培养基常用于菌种的纯化、分离、记数等；液体培养基常用于菌种的扩大培养和工业生产。规律链接(1)培养
20、基主要给培养物提供主要的营养物质，另外还需要满足微生物生长对 pH、特殊营养物质及氧气等的要求，所以根据培 养基成分可以推断培养基的类型以及适于培养的微生物代谢类型。(2)选择培养基是指允许特定微生物生长并抑制其他杂菌生长的培养基，所以配制选择培养基时要明确要筛选的微生物的营养特点和代谢特点。2(1)添加高浓度蔗糖(葡萄糖 ) 调低 pH 是否能在选择培养基上生长 (2) 提供高糖和酸性的筛选环境；获得单菌落；能生长的菌落具有耐高糖和耐酸的特性解析 (1)要筛选耐高糖和耐酸的菌种，培养基中必须加入高浓度蔗糖和调低 pH，能在选择培养基上生长的即为所需菌种。(2)步骤 2 是给其提供高糖或酸性的
21、筛选环境；步骤3 是为了获得单菌落；步骤 4 是根据能生长的菌株具有耐高糖和耐酸的特性筛选出突变菌。3D 在设计实验时，一定要涂布至少 3 个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以 A、B 两项不正确。C 项虽涂布了 3 个平板，但是，其中 1 个平板的计数结果与另两个相差太远 ，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地用 3个平板的计数值求平均值。规律链接 设计实验要遵守单一变量原则和对照原则，同时为避免结 果的偶然 性，使结论更有说服力和准确性，要设置重复组，重复组之间结果相差不大时直接求其平均值；若相差太大，说明操作有误，不能简单求平均值。4D 为避免混淆，最好在使
22、用前就做好标记，对培养皿标记时应注明培养基种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等，故 A、B 错。C 项试管不仅需进行标记，在梯度稀释时，还应按一定顺序依次放在试管架上。达标测试1C 固氮细菌可以在无氮培养基上生长；青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，但不会抑制霉菌的生长；加入 10%的酚的培养基可以抑制细菌和青霉菌的生长，但不会抑制放线菌的生长。2C3B 筛选出能分解尿素的细菌用选择性培养基即可，不需要加指示剂。加入指示剂的培养基， 目的都是对要分离的菌种作进一步的鉴定。4B5A 平板划线法可以用于菌种的纯化和分离，不能用于菌种记数。 6C 制作固体培养基也可以用明胶、海藻酸钠等；青霉素抑
23、制细菌和放线菌的繁殖，乳酸菌属于细菌；发酵工程一般用液体培养基；自生固氮菌能够利用空气中的氮气作为氮源。7D 用稀释涂布平板法对样品中活菌数目进行统计，只是一种估测，根据此方法的实验过程可知，在某一稀释度下涂布的平板菌体数具有一定的偶然性，并不是绝对均匀，所以取若干个平板菌落数量的平均值比较接近样品中菌体数的真实值。8C 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素为氮源，缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源使其生长、发育及繁殖受到抑制，所以，能够选择出分解尿素的微生物。9(1)作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用 (2) 每个稀释度下涂布 3个平板，是作为重复组，以增强实验结果
24、的说服力与准确性 (3)由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气会死亡 (4)鉴别培养基，看是否有分解尿素的细菌存在。结果会变红。原理是分解尿素的细菌产生脲酶并催化下列反应 CO(NH2)2H 2O CO22NH 3，因产 脲 酶 生 NH3，培养基 pH 升高，酚红指示剂呈红色反应 (5) 选择菌落在 30300 的平板进行计数。根据平板所对应的稀释度，对 3 个平板进行重复计数，然后求出平均值，以此估算样品中细菌的数目解析 本题是从反刍动物瘤胃中分离分解尿素的细菌的过程，解题时应注意以下问题：(1)要设立基础培养基牛肉膏蛋白胨培养基作对照，观察选择培养基是否具有选择作用。(2)要设立重复组，
25、取平均值，如每一稀释度下涂布至少 3 个平板，以 增强实验结果的说服力与准确性。(3) 瘤胃是一个厌氧环境，在其中生活的微生物多为厌氧菌，分离时要注意创造无氧环境。(4) 进一步鉴别尿素细菌需在培养基中加入酚红指示剂，若此种菌存在，则会变红，原理是分解尿素的细菌能产生脲酶，作用为催化下列反应：CO(NH 2)2H 2O CO22NH 3。因产生 NH3，使培养基碱性增强， pH 升高，使酚红指示剂呈 脲 酶 现红色反应。(5) 为保证结果准确，计数应选择菌落数在 30300 的平板。10(2)青霉素 无菌 适量芽孢杆菌菌种A 培养基的菌落 获得纯度高的抗青霉素芽孢杆菌 (分离出对青霉素有抗性的芽孢杆菌 )
