1、骨肉瘤相关新分子 5D3Ag 的研究骨肉瘤相关新分子 5D3Ag 的研究何大为刘军(上海第二军医大学长海医院骨科,上海 200433)中国免疫学杂志 2O04 年第 20 卷中国图书分类号 R392.11 文献标识码 A 文章编号 1000-484X(2004)02-01摘要目的:自建的抗人骨肉瘤单克隆抗体 mAbSD3 经鉴定有很好的骨肉瘤细胞特异性,并且已利用单抗纯化出相应的骨肉瘤相关抗原 5mAS 纯品,研究目的是测定 51)3AS 氨基酸序列,鉴定 51)3AS 是否为一新发现的骨肉瘤相关抗原.方法:用 SDS-PAGE 法分析 5mAS 纯度和分子量,并做免疫印迹分析,用半干式转移法
2、将 5133AS 转移到氨基酸测序膜上,测定其氨基酸序列,在蛋白质序列中比较分析,初步推断此抗原的性质及是否为新发现的骨肉瘤相关抗原.结果:5I)3AS 经 SDS-PAGE 分析达到了电泳纯,分子量为 43kI);WcstemBlot 分析显示 5D3AS 可以与mAb5D3 结合;5D3ASN 端 10 个氨基酸序列为:门冬酰胺,谷氨酰胺,甘氨酸,丝氨酸,组氨酸,甘氨酸,丝氨酸,谷氨酸,丙氨酸,谷氨酰胺(NQGSHGSEAQ).结论:5I)3AS 从其分子量来看与以往文献所报道的骨肉瘤相关抗原的分子量都不相同;氨基酸序列结果查询分析,与蛋白质库中已知的蛋白质同源性很低,由此推断 5mAS
3、可能是一种新的骨肉瘤相关抗原.关键词 骨肉瘤 ;单克隆抗体 ;骨肉瘤相关抗原;氨基酸序列分析Identificationofanovelosteosarcomaassociatedantigen5D3AgHE,LIUJun.DepartmentofOrthopeadic,ChanghaiHospital,SecondMiliaryMedicalUniversity,Shanghai200433,Ch/naAharaetObjective:ToanalysistheN-termirmlaminoacidsequenceof5D3ASpurifiedbymAID3immmaonttycolumn.
4、Meth-ods:SDS-PAGEandWcstemBlotwereusedtostudythecharacteristicsof5I)3AS.FromSDS-PAGEgel,5133ASwastransferredtoPVDFInembraheanditsN-terminalaminoacidsequel“iowasanalysisedwithallautoaminoacidsequencer.Results-,SDS-PAGEof5133ASshowedabandonthegdwithmolecularweight0f43kD.WcstemBlotstuayshowedthatmAbSD3
5、call 麒5133AS.TheN-terminalaminoacidsequel“io啪 sNQGSHGSEEQ.C0lKh,西0n:ItisSll_rthat5133ASisuniquetoOstecsarcomabecauseofthepurffleationmethoditselfandthecharacteristicsofmAbSD3.c0 珥.aredwithotherreportedOstecsareomaassociatedantigen,5I)3ASisdifferentfromtheminmolecularweitandmaybeanovel0ste06arc 伽咀 as
6、sociatedantigen.WiththehelpofN-teminalaminoacidsequence,someprimersmaybedesi 乎 l 甜 toclonethewholelgeneof5I)3AS.Theidentificationof5D3ASgenemaybeusefulinIlIeI 砒aIldingthebiologicmechanicsofOsteosarcomaanddevelopingr_哪 diagr10candtherapeuticsmegies.KeywordsOstecsarcoma;Monecolonantibody;Osteosareomaa
7、ssociatedantigen;Aminoacidsequencing骨肉瘤是一种恶性程度很高的,比较常见的原发性恶性骨肿瘤,5 年生存率为 10%20%不等.在诊断上还没有理想的早期诊断方法,很多患者都是在肿瘤发展到晚期才发现.现今肿瘤的治疗以手术,化疗,放疗,生物疗法综合治疗为优.手术虽然可以切除肉眼可见的肿瘤,但不能切除转移的微小病灶;化疗,放疗在杀死肿瘤的同时,又会杀死正常的组织;唯有生物疗法才有可能解决手术所不能解决的问题,其中主动特异性免疫疗法是很值得应用的一种.1975 年,Kohler 和 Milstein 创立了杂交瘤技术,为肿瘤的治疗和基础研究提供了有力的手段.虽然目前已
8、有抗骨肉瘤的单克隆抗体报道,但其应用价值各异.我们已成功地制备了一株抗人骨肉瘤的单克隆抗体 5D3mAb-2J,有非常好的特异性 J,作者简介:何大为(1968 年一),博士,讲师,主要从事骨肿瘤诊治方面的研究.并且已成功地纯化出单抗相应的抗原 5D3Ag,5D3Ag很有可能是一新发现的骨肉瘤相关抗原,有必要加以研究鉴定,5D3Ag 会为骨肉瘤的诊断和免疫治疗提供物质基础.1 材料与方法1.1 实验材料 5D3Ag 为利用 mAb5D3 免疫亲和层析柱,从人源性骨肉瘤细胞 0S-9607 中纯化出的抗原引,另文发表.免疫组化试剂盒 ultraSe 璐 itiveTMS-PKit 购自迈新生物技
9、术公司 .PVDF 氨基酸测序膜购自 Milipore 公司,半干式转移电泳糟为 Bio-Rad产品,垂直平板式电泳槽为北京六一厂产品,电泳仪为 Hoefer 产品 .1.2 方法1.2.1 样品的准备人骨肉瘤 OS 一 96O7 细胞裂解物过免疫亲和层析柱纯化出的骨肉瘤相关抗原5D3Ag 经浓缩,透析除盐,BmoM 法测蛋白浓度,4保存备用.1.2.2 骨肉瘤相关抗原 5D3AgSDSPAGE 分析浓缩胶浓度为 3%,分离胶浓度为 12%,120V 电泳 2小时,将凝胶取下浸于 0.25%考马斯亮兰 R.250 染液中染色 1 小时,脱色,观察结果.1.2.3 骨肉瘤相关抗原 5D3Ag 的
10、 WestemBbt 分析按 2.2 的方法将 5D3Ag 行 SDSPAGE 凝胶电泳,完成后取下凝胶,利用半干式转移系统将凝胶上的 5D3Ag 转移到硝酸纤维素膜上,转移条件为:恒流 0.8mA/cm凝胶,转移 9o 分钟.转移完将硝酸纤维素膜浸入封闭液中封闭,浸入 mAb5D3 腹水(1:2o0)中 4 过夜,加入二抗,37 作用 3 小时,加入ABC 复合物,DAB 显色,观察结果 .1.2.45D3Ag 转移至测序膜上行 N.端氨基酸序列分析 5D3Ag 按前面方法行聚丙烯酰胺凝胶电泳,再由聚丙烯酰胺凝胶转移至测序膜上,取下测序膜,浸入 0.5%丽春红,1% 甲酸染液中染色 1 小时
11、,取出,三蒸水冲洗掉背景;用清洁刀片切下着色目标条带.切下的测序膜浸于甲醇中 15 秒,大量蒸馏水冲洗掉各种离子,4阴干,置于全自动氨基酸序列分析仪中测定 N 端 1O 个氨基酸序列 J.1.2.5 结果鉴定将 N 端 1O 个氨基酸序列结果与http:/www.ncbi,nlm.nih.v 蛋白质数据库比较,鉴定 5D3Ag 是否为未知的蛋白质.2 结果2.15D3Ag 的 SDSPAGE 分析纯化后的 5D3Ag 经透析,浓缩处理后,行 SDSPAGE 分析,在分子量为43kI)处有一条带 ,证明 5D3Ag 达到电泳纯.2.2 纯化的 5D3Ag 特异性鉴定向硝酸纤维素膜上转移后,可见标
12、准蛋白已明显转移到硝酸纤维素膜上,聚丙烯酰胺凝胶经考马斯亮兰染色后,已不再有蛋白带出现,说明转移效果良好.硝酸纤维素膜经封闭,结合抗体,DAB 显色后,在纯化的 5D3Ag 上显出一条带,分子量在 43kD 位置,而作为对照的正常肝细胞裂解液上则没有条带出现.2.3 氨基酸序列分析 5D3 鲰 N 一端氨基酸序列为:缬氨酸,精氨酸,苏氨酸,天冬氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,精氨酸,组氨酸,谷氨酸,丙氨酸(NQGSHGSEAQ).2.4 网上查询检索未发现相同或相类似的蛋白质,5D3Ag 为一新发现的骨肉瘤相关抗原.3 讨论我们利用自建的骨肉瘤细胞系 OS 一 9607 免疫小鼠,制备了一株分泌抗人骨
13、肉瘤单克隆抗体的杂交瘤细胞系 5D3,所分泌的单克隆抗体 mAb5D3 为 IgG2 亚类,培养上清抗体效价为 1:80,腹水为 1:1(y5,此抗体效价高,骨肉瘤特异性强,mAb5D3 在骨肉瘤的基础研究和病理诊断中发挥了重要的作用|3.免疫组化研究结果发现 mAb5D3 相应抗原5D3Ag 存在于骨肉瘤的细胞核中,免疫印迹研究证实 5D3Ag 的分子量为 43kI),这与以往研究发现的骨肉瘤相关抗原,BMP,ALP 等的分子量均不同,说明不是人类组织相容性抗原,也不是血型抗原及其它同种异体抗原 J.许多实验都证实 BMP 在骨肉瘤中大量存在,且与预后有很大关系,但报道的BMP 分子量都在
14、2OkI)以下,所以本文的 43kI)成分不是 BMP,5D3 鲰可能是一种新的骨肉瘤相关抗原.如能纯化出此相关抗原,对骨肉瘤的基础和临床研究有重要的意义,为此,我们利用 mAb5D3 免疫亲和层析柱成功地从骨肉瘤细胞中纯化出5D3Ag,希望对 5D3Ag 进行进一步研究,确定其是否为新发现的骨肉瘤相关抗原.对肿瘤相关抗原的研究有很多方面,包括理化性质,生物活性,一级结构等,氨基酸的排列顺序即蛋白质的一张结构决定了蛋白质的高级结构及功能.因此,测定蛋白质的氨基酸序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分,另外,蛋白质一级结构信息也有助于进行基因结构的研究,知道了蛋白质的氨基酸序列,也可以与蛋
15、白质数据库进行对比研究.研究蛋白质的氨基酸序列是蛋白质研究中比较高级而复杂的工作,以往这方面的工作开展得不多,因为技术手段达不到,现在随着科学技术的进步和对蛋白质研究的深入,蛋白质氨基酸测序工作有了很大的进步.特别是全自动氨基酸序列分析仪的出现,为这方面的工作带来了极大的便利.5D3AgN 一端氨基酸序列为:缬氨酸,精氨酸,苏氨酸,天冬氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,精氨酸,组氨酸,谷氨酸,丙氨酸(NQGSHGSEAQ),经与蛋白质数据库进行比较,未发现相同或相似的蛋白质;另外,5D3 舷的分子量为 43kI),与以往所报道的骨肉瘤相关抗原的分子量都不同;mAb5D3 有很好的骨肉瘤特异性,所以有理由
16、认为 5D3Ag 是一新发现的骨肉瘤相关抗原.得到 5D3AgN 一端氨基酸序列,就可以推测5D3Ag 的部分基因结构,依据此结构,可以设计引物,克隆出编码 5D3Ag 的基因全长,从而在基因水平上研究骨肉瘤相关抗原 5D3Ag,为研究骨肉瘤的发病机理,诊断,治疗提供依据.4 参考文献1 黄纯炽,范清宇.人类骨肉瘤抗原研究的概况J.中华骨科杂志,1994;14(11):686-689.2 何大为,张惠中,裘秀春 da1.抗人骨肉瘤单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及单克隆抗体特异性的研究J.第四军医大学,1999;20(12):14051407.3 何大为,范清宇,裘秀春 eta1.抗人骨肉瘤单克隆
17、抗体 5D3 的特异性鉴定J.细胞与分子免疫学杂志,2001;18(2):161.163.4 杨彤涛,范清宇.裘秀春 ela/.1 株人骨肉瘤细胞系的建立及特异性观察J.第四军医大学,1998;19(3):264-266.5 何大为,范清宇,裘秀春 da1.骨肉瘤相关抗原的纯化及其特异性分析J.中华骨科杂志,1997;17(7):422425.(上接第 107 页)癌 ECad 表达率最低(26.67%), 提示由于 ECad 介导的细胞间粘附作用的减弱使得癌细胞失去控制呈树枝状侵袭生长.不少报道证实癌分化程度降低与ECad 的表达下降之间存在显着的相关性 J.本组6o 例大肠癌中高分化型癌保
18、留大肠上皮形态较多,腺管形成多,其 ECad 表达量也较多;而随着分化程度的降低 ECad 表达量逐渐减少,甚至不表达(P0.05).ECad 与淋巴结转移的关系争议较大,本研究结果发现两者之间呈负相关,但具体机制还有待于进一步研究.而关于 ECad 表达与生存期的关系的研究还不多且存在争议.Lipponen 等发现 ECad 表达与生存期的相关性较弱,且采用多因素分析后发现两者间无显着性差异 J.本研究结果显示ECad 的表达与生存期无相关性.在肿瘤细胞脱离原发灶后,肿瘤细胞通过释放蛋白水解酶降解 ECM 和基底膜,侵犯到周围组织中.而组织金属蛋白酶抑制剂一 2(TIMP-2)可特异地抑制基
19、质金属蛋白酶一 2(matrixmetaUoproteinase 一 2,MMP-2)的活性从而保证基底膜的完整性,限制了肿瘤细胞的侵袭.但关于 TIMP-2 与大肠癌各项临床病理因素的相关性的研究结果差异较大.JooYE等认为 TIMP-2 的表达与所有的临床病理因素均无关6;KikuchiR 等研究认为 TIMP-2 与肿瘤分期,淋巴结转移有关 n.本研究结果显示在大肠腺瘤和大肠癌组织中 TIMP-2 的表达没有显着性差异(P0.05),探究原因,可能是在大肠癌组织中 TIMP-2 的表达发生了某种变化掩盖了两者在统计学上的差异.TIMP-2 的表达与大肠癌的 Dukes 分期,生存期呈正
20、相关,与淋巴结转移和远隔脏器转移呈负相关,中国免疫学杂志 2oo4 年第 20 卷6EdHarlow,DavidIzne.AntibodiesM.In:ShambrookJ,FregeEF,ManiadisT.AlaboratoryManua1.2ndod.NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1988:298299.7 夏其昌.蛋白质分析M.见:夏其昌主编,蛋白质化学研究技术与进展.北京:科学出版社,1997:244-256.8ThorpeWP.RosenbergSA.Semlogleanalysisofhurmn0lnlorantigens(1):
21、antisarcomaantibodiesinthe8era0fpa 五tswithosteogenics 吕|.o-m8s【 J.JNCI,1979;62;11431145.9YoshikawaH.PrognosticsignificanceofbonemorphogeneticactivityinOsteosarcnatissueJJ.Cancer,1988;61:509511.收稿 20021215 修回 9.0030326(编辑许四平)即分期越晚,TIMP-2 表达越低,淋巴结和远隔脏器转移发生率越高,预后也越差,暗示 TIMP-2 对 MMP-2 的抑制作用随着大肠癌的恶化而逐渐减弱
22、,可能会最终丧失抑制 MMP-2 的能力.由此可见,ECad 和 TIMP-2 的检测可以成为临床判断大肠癌的恶性程度及转移的重要参考指标,而且 TIMP 一 2 的检测可用来判断大肠癌患者的预后 .4 参考文献1LiottaLA.Stetler-StellsonWG.TumorinvasiOnandmetastasisanim-balanceofpositiveandnegativeregulationJ.CancerRes,1991;51:5O54-5069.2SimardD.NabiIR.Inverserelationofautocrinemotilityfactorreceptoran
23、dEcadherinexpressionfollowingMDCKepithelialcelltransformationJ.BioehemBiophysResComlmm,1996;219:122127.3RingP,JohanssonK,UoyhMela/.ExpronoftissueinhibitorofmotalloproteirmsezTIMP-2inhuwancolorectalcarK 盯 apredictorof 缸】一rn0urstaJ.BritishJofCancer,1997;76(6):805-811.4KleinerDE,Stetler-StevensonWG.Mat
24、rixmetalloproteinasesandmetastasisJ.CancerQaemotherPharmacd,1999;43:4251.5LipponenP,SaarelainenE,JiHet.Expression0fE-cadherinasrdatorstootherprognosticfactorsandsurvivalinbreastcanceTJj.JPathd,1994;174:101109.6JooYE.SeoKS,KimJ.Role0ftissueinhibitorsofmetalloproteinases(TIMPs)incolorectalcarcinonmJ.JofKoreanMedicalScience,1999;14(4):41723.7kikuchiR,NoguchiT.1rmmmohistochemicaldetectionofmembrantype-1-matrixmotanoproteinaseincolorectalcarcinoma【J.BfitishJofCan cer.2000;83(2):215-218.收稿 2002.09-09 修回 2002?12-03(编辑张慧)
