1、白细胞介素12的抗肿瘤机理研究 斯坦福大学医学院外科 宗康拉,内容提要,白介素12的抗肿瘤效果 白介素12的抗肿瘤机理 白介素12可能的临床应用 白介素12的历史 白介素12在国外的现状 白介素12申报国内肿瘤治疗的可行性,白介素12的抗肿瘤效果,Interleukin 12 (IL-12) 白介素12,由抗原呈递细胞在受到外源物质（包括内毒素）刺激时分泌 属于“危险信号”之一：和外源侵入相关 修饰T细胞或者NK细胞，决定后天免疫走向 先天免疫与后天获得性免疫之间的衔接因子 刺激靶细胞g-干扰素分泌（Th1型免疫应答） 至今发现的最有效的抗肿瘤单因子 作用与范围与内毒素十分相似 单独用药可以治
2、愈小肿瘤（1cm),能发表的疗效 1) 抑制性作用 (90%) 2) 肿瘤体积减小（少见) 3) 治愈 （罕见),治疗,0-30 天,肿瘤细胞,如何做肿瘤治疗效果试验,白介素单独使用的最佳治疗效果实例,白介素单独治疗一般只对某些初期建立的小肿瘤（3周）的大肿瘤负担（15毫米直径，%体重）一般无法治愈 白介素配合化疗在某些肿瘤模型有出奇的疗效,白介素12 结合化疗治疗 32天小鼠MCA207肿瘤模型：治疗前,环磷酰胺加白介素12（Cy+IL-12)治疗一周,环磷酰胺加白介素12治疗2周,环磷酰胺加白介素12治疗3周,环磷酰胺加白介素12治疗4周,环磷酰胺加白介素12治疗5周,环磷酰胺加白介素12
3、治疗6周,通过白介素12提高化疗的抗肿瘤效果,no Rx,Cy alone,IL-12 alone,Cy+IL-12,18天腹腔实体MCA207肿瘤,14天静脉注射建立的肺扩散肿瘤模型,Cy+IL-12在腹腔及肺扩散肿瘤模型中的治疗效果,接瘤途径,治疗（起始天数）,治愈率（存活天）,i.p.腹腔,i.p.腹腔,i.v.肺扩散,对照,Cy+IL-12 (18),Cy+IL-12 (14),0/5 (20-27),0/5 (21-31),5/5 (90),8/8 (90),i.v.肺扩散,对照,IL-12和Cy+IL-12在Sa1腹水肿瘤模型中的治疗效果,100%,50%,0%,对照,IL-12,
4、Cy,Cy+IL-12,0,10,20,30,40,接种,治疗,存活率,天数,白介素12的抗肿瘤机理研究,Cy+IL-12的抗肿瘤作用是Th1型T免疫应答,宿主,治愈率,正常,T细胞受体敲除鼠 （T细胞缺失）,裸鼠 （T和B细胞缺失）,咖玛干扰素敲除鼠 （Th 1型缺失）,白介素-4敲除鼠 （Th 2型缺失）,10/10,0/5,0/20,0/20,10/10,与肿瘤排斥所对应的强免疫反应,CD4,CD8,治疗之前,治疗之后,白介素12启动的抗肿瘤免疫细胞分布,例子1,例子2,T细胞,巨嗜细胞,巨噬细胞可能是靶效应细胞的证据,T 细胞染色,TUNEL自杀细胞染色,H&E组织学染色,巨嗜细胞染色
5、,白介素12启动的抗肿瘤免疫应答对肿瘤增生的抑制,对照,治疗,溴嘧啶标记肿瘤增生,环磷酰胺加白介素是否对所有肿瘤有效？,有效肿瘤模型:C57B/6: MC203, MCA205, MCA207, FBL-3BALB/c: CT26, CSA1M, OV-HMA/J: Sa1 无效肿瘤模型:C57BL/6: MCA101,B16, LLC, Pan02, EL-4C57BL/6: autochthonous primary tumorsBALB/c: 4T1, S180,为什么白介素12在有的肿瘤治疗模型里如此有效，但在其他肿瘤治疗模型几乎无效？,对白介素12有无应答的肿瘤模型对比,免疫型肿瘤
6、与 共存(预存)免疫的概念,免疫型肿瘤就是能够在接种后不久自动诱发宿主免疫识别的肿瘤 识别的结果肿瘤生长与抗肿瘤免疫共存,什么是共存（预存）免疫？,肿瘤与抗肿瘤免疫之间的平衡 宿主免疫系统对肿瘤抗原有特异性识别 肿瘤通过提供抗原维持这个免疫应答 这个免疫应答对肿瘤有遏制作用 应答的性质属于Th1型细胞应答,预存免疫的状态决定IL-12或Cy+IL-12疗效,免疫细胞转导试验步骤,正常供体小鼠,肿瘤疫苗,肿瘤接种,排斥接种,T细胞缺失受体小鼠,肿瘤接种,14 day,输入T细胞,T cell,IL-12/Cy+IL-12 治疗,治疗效果?,2 day,预存免疫在白介素12治疗中的关键作用,输入细
7、胞,治疗,治愈率,无,未分化T细胞,肿瘤特异T细胞,IL-12,生理盐水,IL-12,IL-12,Cy+IL-12,0/10,0/8,0/8,1/10,9/12,10/10,Cy+IL-12,0/5,未分化T细胞,未分化T细胞,肿瘤特异T细胞,肿瘤特异T细胞,生理盐水,受体：带MCA207肿瘤14天的T细胞缺失小鼠,荷瘤鼠作为T细胞供体（预存免疫）的试验,供体细胞,治疗手段,治愈率,生理盐水,IL-12,IL-12,Cy+IL-12,Cy+IL-12,0/5,0/5,3/5,0/5,5/5,5/5,荷瘤0天脾脏T cell,Cy+IL-12,0/5,受体：带MCA207肿瘤14天的T细胞缺失小
8、鼠,荷瘤10天脾脏T cell,荷瘤10天脾脏T cell,荷瘤10天脾脏T cell,荷瘤28天脾脏T cell,荷瘤28天脾脏T cell,荷瘤28天脾脏T cell,生理盐水,预存免疫是决定荷瘤鼠对白介素12治疗应答与否的关键条件 为什么？,白介素12受体表达特征,未分化T细胞不表达白介素12 受体（不受影响） 激活的T细胞表达白介素12受体 表达为激活后的37天内，以后不再表达,环磷酰胺加白介素12疗效解释上的一个困惑 如果对白介素12应答好坏由受体表达决定， 那化疗是如何提高白介素12受体表达的？,传统的解释,肿瘤晚期免疫受到抑制 抑制性T细胞（Treg）生成 T细胞不表达白介素12
9、受体 对白介素12单独治疗不应答 化疗药杀死Treg 抑制性T细胞由于代谢较高，对化疗药敏感 去除抑制性T细胞之后释放了被抑制的抗肿瘤应答 抗肿瘤T细胞被激活，表达白介素12 受体,去除免疫抑制在我们的肿瘤模型中不起关键作用 其他解释？ 化疗对肿瘤的杀伤导致抗原释放激活预存免疫,化疗激活抗肿瘤免疫？ 我们做的是化疗还是免疫治疗？,预存免疫的状态决定化疗疗效 免疫参与对化疗疗效的贡献 化疗的疗效在没有免疫功能的情况下会不同吗？ 无法在人体内进行对比 但可以在试验小鼠体内进行对比,T细胞对肿瘤发展与化疗疗效的影响,治疗开始后天数,肿瘤大小,正常鼠+环磷酰胺,T细胞敲除鼠+环磷酰胺,正常鼠+对照,T
10、细胞敲除鼠+对照,阿霉素与建择在正常与T细胞缺失鼠中的疗效对比,治疗开始后天数,肿瘤大小,正常鼠+阿霉素,T细胞敲除鼠+阿霉素,正常鼠+建择,T细胞敲除鼠+建择,相似的疗效差异用T细胞清除抗体也能看到,治疗开始后天数,肿瘤大小,环磷酰胺,环磷酰胺+ 抗CD4/CD8,阿霉素,阿霉素+抗CD4/CD8,抗CD4/CD8,大肿瘤模型中T细胞对化疗疗效的贡献,治疗开始后天数,肿瘤大小,正常鼠+环磷酰胺,T细胞敲除鼠+环磷酰胺,化疗是如何激活抗肿瘤免疫的呢？,药物对肿瘤细胞的直接杀伤是必要条件 排除去抑制解释：杀死抑制性T细胞（Treg） 直接杀伤导致抗原短期集中释放 释放的肿瘤抗原不足以启动全新的抗
11、肿瘤应答，但可以激活预存的抗肿瘤应答,其他化疗药与白介素12的联合使用疗效,化疗+IL-12,治愈率（%）,阿霉素（全身）,80100,环磷酰胺,阿霉素（瘤内，脂质体）,0,60100,建择（全身）,020,建择（瘤内，自由体）,2040,5氟,0,长春碱,0,肿瘤模型：24周MCA207皮下肿瘤， 1017毫米直径 治疗：化疗单次给药，3天后开始白介素12（隔天一次x3次） 化疗或者白介素12单独对照0%治愈率,药物必须对肿瘤细胞有足够的直接杀伤,药物及剂量,对体细胞及肿瘤的杀伤,疗效 （与对照比较）,环磷酰胺25mg/kg,10%,无,环磷酰胺50mg/kg,30%,弱,环磷酰胺75mg/
12、kg,60%,显,环磷酰胺100mg/kg,50%,强,环磷酰胺125mg/kg,70%,强,阿霉素10mg/kg 全身,10%,无,肿瘤,Treg,70%,90%,100%,100%,100%,白细胞,10%,30%,30-50%,50%,70%,50%,?,阿霉素5mg/kg瘤内,50%,10%,?,显,建择150mg/kg全身,10%,30%,?,无,建择50mg/kg瘤内,30%,30%,?,显,模型：1014天MCA207皮下肿瘤,宿主必须具备预存免疫,免疫型（immunogenic)与非免疫性（non-immunogenic）肿瘤的差别 免疫型：能在宿主中诱发免疫识别的肿瘤 非免疫
13、性：不能诱发免疫识别的肿瘤 免疫型与非免疫型是个相对概念 加强预存免疫可以提高疗效 预存免疫是另一个保障化疗疗效的必要条件 肿瘤疫苗的作用,提高预存免疫可以增强化疗疗效,单独化疗不足以治愈大肿瘤负担 提高预存免疫可以通过转入抗肿瘤细胞实现 单纯转入抗肿瘤细胞无法看到明显抗肿瘤效果 如果在提高预存免疫之后开始化疗呢？,提高预存免疫可以增强化疗疗效的实例 （先过继抗肿瘤免疫细胞后再化疗的试验）,化疗开始后天数,肿瘤大小,-2天过继未分化脾细胞+Cy,-2天过继抗肿瘤脾细胞+Cy,）14天的MCA207肿瘤模型；）细胞转导后第三天化疗,无治疗对照,过继抗肿瘤脾细胞,过继预存免疫需要在化疗前或者3天之
14、内而不是化疗有效后（7天）实施才会有效,化疗开始后天数,肿瘤大小,Cy 3天+过继抗肿瘤脾细胞,Cy 7天+过继抗肿瘤脾细胞,Cy,过继的抗肿瘤免疫细胞是否被化疗释放的肿瘤抗原激活？,单独化疗有效期,抗肿瘤T细胞过继,无效,抗原集中释放期,有效,0,14,-2,7,化疗后伴随的肿瘤坏死,MCA207肿瘤对照,环磷酰胺3天后,化疗后局部注射树突细胞可以提高疗效,化疗开始后天数,肿瘤大小,对照,Cy,Cy+ DC (2天),Cy+ DC (6天),过继的抗肿瘤免疫细胞是否被化疗释放的肿瘤抗原激活？,单独化疗有效期,抗肿瘤T细胞过继,有效,抗原集中释放期,0,14,-2,7,局部树突细胞注射,无效,
15、化疗激活抗肿瘤免疫的直接证据,体内测试：Winn氏法检验脾细胞抗肿瘤活性 体外测试：肿瘤抗原刺激下的T细胞干扰素释放 瘤内检验：化疗前后T细胞浸润对比,Winn氏法检验脾细胞抗肿瘤活性,肿瘤与脾（免疫）细胞混合后接种 无抗肿瘤能力的脾细胞能促进成瘤（feeder） 有抗肿瘤能力的脾细胞能抑制成瘤 抗肿瘤能力是否特异可以用不相关肿瘤做对照 特异性表明是T细胞应答 通过观察成瘤的时间和成（抑）瘤率可以测试脾细胞中是否含有特异抗肿瘤免疫细胞 肿瘤免疫的金标准,化疗前后宿主体内抗肿瘤免疫能力的对比,抑瘤率,接瘤后时间（天）,对照,化疗后10天,化疗后7天,化疗后3天,对照： 1）未分化脾细胞+207肿
16、瘤2）207免疫脾细胞+203肿瘤,化疗前后宿主脾细胞对肿瘤抗原的体外应答,细胞免疫（Th 1型）应答是抗肿瘤的最佳应答 抗肿瘤特异的T细胞受到抗原刺激时分泌干扰素 脾细胞与加了肿瘤抗原的树突细胞共培养 测试伽玛干扰素的分泌 伽玛干扰素水平可以表明抗肿瘤应答的活性 优于传统的CTL法（很少有假阳性）,化疗前后宿主脾细胞对肿瘤抗原的体外应答,伽玛干扰素分泌,未分化化疗前Cy 阿霉素长春碱,7天后,化疗前后瘤内免疫细胞浸润的变化,化疗前,化疗后10天,每组5个肿瘤的切片,化疗直接杀伤,抗原释放,激活预存免疫（记忆应答）,攻击肿瘤,疗效？,肿瘤死亡,化疗的免疫学解释,化疗的最终疗效是直接杀伤和免疫攻
17、击的总和 病人对化疗应答的巨大个体差异有可能来自： 1）治疗时抗肿瘤预存免疫的水平 2）药物是否可以杀死肿瘤 3）死亡的肿瘤是否可以释放可识别抗原 4）激活的抗肿瘤免疫是否可以持续,激活的抗肿瘤免疫是否可以持续？ （复发和耐药）,一次化疗开始后天数,肿瘤大小,环磷酰胺（Cy ）,为什么应答不彻底？ （免疫对肿瘤的攻击出现停顿？） 为什么会出现耐药？ （传统的耐药解释对吗？）,传统的肿瘤耐药解释,肿瘤在药物杀伤的压力下选择耐药株 耐药株的比例随着化疗的进程不断放大以至于占到肿瘤的大部分甚至全部 耐药的机理可以是单独针对单一药物的，比如靶蛋白结构的突变 普遍耐药的机理可以是通过提高药物单向传导（排
18、除出细胞）来完成（比如MDR离子泵）,传统的耐药解释是可以验证的,野生株肿瘤,接种,荷瘤鼠,化疗,应答,不耐药,耐药株肿瘤,接种,荷瘤鼠,化疗,不应答,耐药,应答,耐药不是来自肿瘤的变化,传统解释正确,抗药性不是由于筛选了抗药性肿瘤细胞株,接种细胞来源,化疗治愈率,原始瘤株（MCA207),一次化疗后复发的肿瘤,二次化疗后抗药的肿瘤,8/10 (80%),9/10(90%),8/10(80%),接种10天后荷瘤鼠接受环磷酰胺化疗 治愈：肿瘤完全消退后无复发（90天）,获得性耐药的免疫解释,治疗开始后天数,肿瘤大小,正常鼠,免疫缺失鼠,既然抗肿瘤免疫贡献了疗效的很大部分，当这个应答不再启动时就会
19、造成疗效明显下降,耐药与抗肿瘤应答的关联,耐药的荷瘤鼠体内看不到化疗后的免疫应答 Winn氏法测试：没有抗肿瘤靶效应细胞存在 体外与树突细胞共培养：没有伽玛干扰素分泌 瘤内T细胞浸润：明显减少 为什么抗肿瘤免疫不再激活？ 预存免疫“衰竭” 自身抗原的主动耐受 其他？,补充预存免疫不能扭转耐药的试验,预存免疫,二次化疗,二次化疗,过继后二次化疗,一次化疗后时间,肿瘤大小,结论：预存免疫衰竭不是耐药的原因,免疫耐受的可能,耐受是机体保护自身免疫攻击的有效机制 耐受与否取决于机体对抗原外源性的判断 外源性侵入往往伴随机体分泌“危险信号” 没有危险信号情况下的免疫应答自身抗原？ 肿瘤本质上是自身组织，
20、不能诱发危险信号 在没有危险信号条件下的抗肿瘤的应答有可能被机体看作自身免疫,支持免疫耐受解释的试验观察 （干预化疗疗效的细胞过继试验）,化疗开始后天数,肿瘤大小,细胞过继,环磷酰胺,未分化脾细胞,耐药脾细胞,非耐药脾细胞,如何防止耐受提高疗效？,防止机体把抗肿瘤应答看作自身免疫 引入“危险信号”？ 危险信号一般由细菌及病毒诱导陀样受体（Toll like receptor）产生 内毒素是典型的危险信号诱发因子 内毒素诱发的危险信号之一就是白介素12 化疗后提供内毒素或者白介素12可以“欺骗”机体，把抗肿瘤应答误认为是抗外源侵入应答,白介素12与化疗联合使用的其他例子 （与局部阿霉素联合使用）
21、,化疗开始后天数,肿瘤大小,IL-12,阿霉素9天+IL-12,阿霉素3天+IL-12,为什么白介素12的用药时间很关键？,白介素12必须在化疗之后提供 T细胞激活后表达白介素12受体 化疗之后最佳使用期：27天内 白介素12受体表达短暂：24天 白介素12修饰过的T细胞不受抑制调控 白介素12不能改变已经接受负调控的T细胞（不表达白介素12受体）,局部阿霉素加白介素12在MCA203肿瘤模型里的治疗试验,局部化疗可以用来评判化疗的直接杀伤与化疗激活的免疫杀伤各自对疗效的贡献 但环磷酰胺是前体药物，不能局部给药 阿霉素脂质体可以局部给药 如果化疗一个病灶并激活免疫，对远端病灶会有什么疗效？ 双
22、侧接种的MCA203肿瘤模型可以用来回答以上问题,白介素12与化疗联合使用的其他例子 （MCA203肿瘤模型）,化疗开始后天数,肿瘤大小,化疗侧,非化疗侧,阿霉素,IL-12,阿霉素+IL-12,局部建择加树突细胞加白介素12在低免疫性肿瘤Pan02模型中的疗效,治疗开始后天数,肿瘤大小,建择+DC+IL-12, 6/10,建择+DC+IL-12, 4/10,建择+IL-12,无治疗对照,为什么白介素12与化疗的联合治疗在某些情况下极为有效？,化疗集中释放的大量肿瘤抗原激活预存免疫 活化的T细胞表达白介素12受体 外源提供的白介素12模拟危险信号 机体认为激活的免疫应答是抗外源侵入 白介素12
23、修饰的T细胞不再受抑制性调控 抗肿瘤的应答得以扩大和持续,化疗加白介素12启动的抗肿瘤免疫与持续化疗的关系,环磷酰胺单药加白介素12只需一个疗程 与目前临床持续化疗的实践不符合 后续化疗对免疫的打击？ 临床应用问题：需要改变现有的化疗程序吗？ 试验模型： Cy+IL-12激活免疫 其他化疗制造外周血白细胞下降 观察疗效及肿瘤局部免疫细胞变化,其他手段对Cy+IL-12疗效的干扰试验,无治疗,Cy+IL-12,+建择,+5Fu,+抗CD4/8,干扰药物：Cy+IL-12结束时（7天）开始 建择：每三天一次，每次2毫克， 一共4次 5Fu ：5Fu 每天2毫克加叶酸（1.25毫克），8天（半数毒性
24、致死） 抗CD4/8：200微克抗体连续2天.以后每周一次x2周,肿瘤大小,外周血,脾脏,4M,110M,2.9M,132M,35M,2.1M,0.2M,33M,2.3M,92M,结论 白介素12启动的抗肿瘤应答一旦启动后有很强的持续和抗抑制能力,免疫对肿瘤宿主生存的支持 肿瘤晚期，恶液质以及免疫紊乱 白介素12的抗恶液质与抗肿瘤综合效果,肿瘤晚期的现象,出现恶液质（消瘦衰竭代谢内分泌紊乱） 停止对治疗的应答（手术和其他减负治疗） 肿瘤发展加速肿瘤生长本身造成的？ 有些病人只有肿瘤标志物但几乎看不到复发病灶 癌症病人死于肿瘤的直接作用吗？ 除了功能性占位，肿瘤如何致死？,有恶液质的癌症病人死于
25、免疫紊乱而非肿瘤,肿瘤可以诱发恶液质的产生 恶液质，而非肿瘤，导致晚期症状 恶液质是独立致死疾病 恶液质的本质是系统炎症（免疫紊乱） 抑制系统炎症可以抑制恶液质和死亡 抗肿瘤免疫应答是最好的恶液质抑制和调控手段 恶液质的发生标志着抗肿瘤免疫的消退,恶液质的临床表现,体重下降（肌肉和脂肪萎缩） 厌食，恶心，呕吐 弓背，眼窝塌陷 精力及体力萎靡，丧失活动欲望 胸腹水，水肿（肝脏功能低下） 低烧，白细胞及中性粒细胞增加，特异免疫低下 凝血异常（DIC，内出血） 代谢紊乱 心肺及其他器官衰竭,实验室与临床的脱节：缺少合适的动物模型,绝大多数动物肿瘤模型不形成恶液质 肿瘤负担可以达到基本上与体重相似而不
26、会致死 极个别早期恶液质模型主要以体重下降为表现 缺少有临床表现且肿瘤负担不大的模型,CHX207恶液质模型： 皮下中小肿瘤导致恶液质及死亡,为什么恶液质模型如此重要？,大多数癌症病人死于恶液质的直接或间接作用 传统治疗（手术，放化疗）有可能加速恶液质病人的死亡（医生的忌讳） 在非恶液质模型中开发的药物不适用恶液质状态下的治疗（加速死亡） 恶液质与特异抗肿瘤免疫之间相互排斥,问题出在认识上 恶液质是癌症晚期的结果还是原因？,肿瘤生长,进入晚期,恶液质,死亡,传统观念,新观念,肿瘤生长,进入晚期,恶液质,死亡,恶液质和非恶液质模型的对比,体重变化%,接种后生长天数,恶液质模型,非恶液质模型,恶液
27、质模型的发病率，生存期及体重变化,恶液质发病率,发病后生存率,体重变化率,发病率：14天50%；18天70% 生存率：70%死于发病后310天,肿瘤负担：发病（两天内7%体重下降）,肿瘤负担：死亡,体重，大小，脂肪，肌肉比较,正常荷瘤鼠,恶液质荷瘤鼠,宿主怎么就死于一个不大的皮下肿瘤？ 肿瘤诱发的恶液质导致宿主进入晚期和死亡,恶液质的本质是什么？怎么导致宿主死亡？,恶液质是一个临床而不是病理表述 恶液质的机理一直不清楚 早期认为是由于某些免疫因子（白介素6） 恶液质致死的原因不清楚（代谢紊乱？） 近期临床上观察到伴随系统炎症（因果不清）,什么是系统炎症？,先天免疫和获得性免疫 系统炎症是先天免
28、疫亢奋的表现 由大量体细胞急性死亡启动 无法过渡到获得性免疫（缺少抗原） 系统炎症疾病： 急性：脓毒症；器官缺血灌注，无感染创伤（手术） 慢性：乙肝；艾滋病；肺结核；慢性肾衰竭；某些慢性关节炎和心脏病；糖尿病等慢性顽疾 粒细胞总数及比例升高，T细胞总数及比例下降,恶液质和系统炎症：伴随还是机理？,白细胞,T细胞,中性粒细胞细胞,正常值,抑制炎症能防止或逆转恶液质吗？,传统炎症抑制手段： 激素：强地松 非激素类：塞来昔布 化疗药物：建择，环磷酰胺 免疫调控 获得性免疫与先天免疫之间的关系 抗肿瘤免疫的双重意义,激素（强地松）对恶液质发病和死亡的影响,发病率,死亡率,强地松= 5mg/kg/天 x
29、 10天,A,塞来昔布抑制恶液质的进展并延长生存,B,C,发病后天数,接种后后天数,接种后后天数,生存期,体重变化,肿瘤大小,对照组,治疗组,治疗组,对照组,塞来昔布：发病两天后开始，5毫克/天x10天,吉西他滨（建择）的抗炎症及恶液质效果,生存期,体重变化,肿瘤大小,发病后天数,接种后天数,对照组,治疗组,建择：发病两天后开始给药，1毫克x2天,吉西他滨抗炎症效果,T细胞,粒细胞,白细胞总数（百万）,3.9,8.3,1.9,1.0,观察结果 抑制炎症可以逆转恶液质症状延长生存 结论 系统炎症是造成恶液质和死亡的原因,T细胞对恶液质发病率即病程的影响,发病率,生存率,对照鼠,T细胞缺失,T细胞
30、对恶液质发病率即体重的影响,没有T细胞的小鼠,正常小鼠,不诱导恶液质的肿瘤,通过提高抗肿瘤免疫可以防止恶液质的发生和发展吗？,试验一：通过细胞转导在恶液质发生前输入抗肿瘤T细胞，观察恶液质的发病率变化试验二：某些化疗药物（环磷酰胺）的抑制炎症与激活免疫综合作用试验三：白介素12的抗恶液质的直接与间接作用,通过输入抗肿瘤T细胞来抑制恶液质,发病率,生存率,无输入,未分化T细胞,抗肿瘤T细胞,抗肿瘤T细胞,未分化T细胞,无输入,肿瘤接种后天数,发病率%,生存率%,环磷酰胺的综合抗炎症及免疫激活效果,生存率,抗肿瘤,体重变化,对照组,Cy,Cy+抗CD4/CD8,Cy,Cy+抗CD4/CD8,对照组
31、,Cy,Cy+抗CD4/CD8,days after tumor inoc,days after cachexia onset,days after cachexia onset,IL-12,对照组,days after tumor inoc,体重变化,白介素12的抗恶液质效果高剂量（100ng）,生存率,对照组,IL-12,肿瘤大小,体重变化,体重/生存率,肿瘤大小,IL-12,对照组,白介素12的抗恶液质效果低剂量（20ng）,跟踪研究以及结论,白介素12具有直接与间接抗恶液质的作用 白介素12的直接抗恶液质作用不需要通过T细胞，但需要通过伽玛干扰素 白介素12的间接抗恶液质作用是通过抑制
32、恶液质后激活抗肿瘤特异性免疫应答进一步抑制肿瘤 白介素12的抗恶液质作用不需要大剂量，但需要常剂量（每天一次）,白介素12的临床应用分析,白介素12的开发历史,1989年完成分子鉴定 1990年申请分子和应用专利（抗肿瘤和感染） 1991发表抗肿瘤动物实验 19921994 开展早期临床实验（一期和二期） 1994年出现严重临床副作用（两例死亡） 19962005年开展后期临床试验 2005年白介素12供应中断 2008美国NIH启用最后一批过期白介素12 2010年白介素12专利过期,白介素12早期临床试验,GI/Wyeth做的一期临床 40肿瘤病人（肾癌，黑色素癌，直肠癌） 身体状况良好（
33、Karnofsky指数70） 31000ng/kg/day 静脉给药，每周5天，隔周重复，一共两次 一个CR（melanoma)，一个PR(RCC) MTD为500ng/kg 毒副作用： 感冒症状（发烧，恶心，呕吐，厌食，懒惰） 口疮 肝脏转胺酶升高 血液白细胞，淋巴细胞暂时下降（3080）,白介素12早期临床试验,Roche做的准一期临床 10例黑色素瘤病人 皮下给药，每周一次，500ng/kg 有混和临床疗效，但达不到PR标准 毒副作用： 感冒症状 肝脏转胺酶升高 血液白细胞，淋巴细胞暂时下降,白介素12早期临床试验,Roche做的一期临床 28例肾癌病人 皮下给药，每周一次，100-12
34、50ng/kg MTD为1000ng/kg 1PR（500ng/kg） 毒副作用： 感冒症状（发烧，恶心，呕吐，厌食，懒惰） 口疮 肝脏转胺酶升高 血液白细胞，淋巴细胞暂时下降（3080）,白介素12早期临床试验,Roche做的二期临床试验 设计80例，实际30例肾癌病人 皮下给药，每周一次，逐渐上升到1250ng/kg 2例PR 没有明显的毒副作用 试验由于达不到预期的临床疗效而停止,白介素12的二期临床事故,GI做的二期临床 17肾癌病人 500ng/kg静脉给药，每周5天 12个病人在两次注射之后发生4级副作用 2个病人最终死于副作用（胃肠道出血和结肠炎）,白介素12二期临床事故的原因,
35、二期省略了预备注射（pre-dosing)步骤 预备注射是在连续注射之前一周单独给药 预备注射降低了连续给药时的血液伽马干扰素水平 动物（小鼠和猴子）试验可以证明预备注射降低毒副作用的意义 实际问题是只要控制伽马干扰素水平就可以防止白介素12的毒副作用,白介素12后期临床试验,自从事故发生后，两家公司均对高剂量白介素12的临床应用产生怀疑 此后的白介素12肿瘤临床试验多为学术机构以研究为目的进行的中低剂量试验 新的动物试验表明低剂量的白介素12有时也可以起到抗肿瘤效果,白介素12后期临床试验,降低给药频率，但保持500ng/kg给药量 28个肾癌病人 每周两次（第一，四天）静脉注射 一个PR三
36、个SD 停药后仍观察到持续的肿瘤消退 没有严重毒副作用 因为疗效与伽马干扰素的持续诱发相关，认为增加白介素2可能会提高疗效（后来证明是错误的）,白介素12后期临床试验,皮下注射，降低单次药量，增加频率 15个肾癌，黑色素癌及大肠癌病人 每周三次，每次50，100，300ng/kg 1CR（50ng/kg),1PR(300ng/kg) 毒副作用： 白细胞，淋巴细胞和中性淋巴细胞抑制 肝脏转胺酶升高 Beta2-微球蛋白及C反应蛋白升高(系统炎症）,白介素12后期临床试验,低剂量白介素12与疫苗结合 黑色素癌抗原Melan-A的片段 IL-12:0100ng/kg,第一，第22天（静脉或皮下） M
37、elan-A肽段：第1，8，15，22，57 gp100试验： IL-12:30ng/kg与肽段同时，同点皮内注射 gp100:两周一次（x2)到四周一次(x2)到八周一次 没有明显毒副作用 没有明显白介素12与临床效果的对应,白介素12临床失败的主要原因,没有掌握白介素12 的最佳使用条件 没有在T细胞激活时给药 排除任何接受放化疗的病人 没有给药依据 白介素12受体表达不明：没有任何测试 给药剂量错误 高剂量造成NK细胞激活，T细胞抑止 大量游离伽马干扰素的副作用明显,白介素12在抗病毒方面的临床试验,抗艾滋病（HIV）一期临床试验 65个艾滋病毒感染者 CD4细胞数300x106 皮下注
38、射，30-300ng/kg, 一周两次（共4周） 没有明显毒副作用 没有明显的抗病毒效果 体外细胞特异免疫功能没有明显变化,白介素12在抗病毒方面的临床试验,抗慢性丙肝病毒（HCV）的I/II期临床试验（Roche) 60个慢性丙肝病人 皮下注射，30-500ng/kg,每周一次，一共10周 毒副作用同以前报道过的相同，不严重，与剂量有关 根据剂量有17-53的病人病毒RNA量下降50% 肝脏转胺酶没有明显下降 没有完全病毒转阴的情况 疗效比不上a干扰素（10转阴）,白介素12在抗病毒方面的临床试验,抗慢性丙肝病毒（HCV）的临床试验（GI） 225个抗a干扰素的慢性丙肝病人 皮下注射，500
39、ng/kg,每周两次，一共12周 百分之三的病人因副作用退出试验 百分之一的病人中有疗效 肝脏活检没有发现明显变化 肝脏转胺酶水平没有明显下降,白介素12在抗病毒方面的临床试验,抗慢性乙肝病毒（HBV）的临床试验（Rohe） 46个慢性乙肝病人 皮下注射，30,250,500ng/kg,每周一次，12周 病毒转阴率：15左右 病毒转阴伴随HBeAg抗原转阴和转胺酶正常化 副作用与剂量相关但没有严重情况出现,为什么有些乙肝病人有应答而另一些没有？,白介素12的主要功能是修饰激活后的T细胞，防止耐受 在没有T细胞激活的情况下，白介素12主要靠NK生成的伽马干扰素有一些左右，但不治本 个别病人在治疗
40、期间发生自发的病毒免疫应答造成对白介素12 的应答,白介素12的当前处境,基本分子专利于2010年到期 两家美国公司已于2000年之前放弃自己进行白介素12的临床开发 剩余的白介素12由GI公司交给美国NIH使用 从2005年6月以后GI拒绝继续向NIH提供临床级白介素12 2008年美国NIH将最后一批过期的白介素12投入临床实验,重新启动白介素12临床应用的机会,美国Wyeth公司因为临床事故与缺乏疗效而放弃了白介素12 的开发 中国药厂指望白介素12在美国上市后仿制的道路已经堵死 中国有数家重组白介素12的GMP生产 中国有庞大的白介素12应用适应症人群：肿瘤，乙肝，艾滋病 这些因素与我们最新理念的结合,白介素12的临床最佳应用角度,肿瘤治疗方面 常规放化疗对实体瘤的一部分（1040）有抑止但无法根治 无法根治的原因一部分是因为放化疗激活的免疫反应进行不彻底并形成免疫衰竭甚至耐受 白介素12一方面推进免疫反应的强化和深化，另一方面防止耐受,实体瘤（肺癌，乳腺，消化道，肝癌等）,放化疗,急性免疫回放反应,抗原释放,树突细胞,应答，耐受，复发,死亡,白介素12,持续应答,治愈或带瘤生存,谢谢大家的耐心,
