1、1,发酵培养-五,第八讲 第十一章 微生物培养过程的参数检测物理参数的测定化学参数的测定生物参数的测定,2,一、 概述物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、表观粘度、浊度、罐压、泡沫等。化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷等）、pH、产物浓度、溶氧浓度、 CO2浓度、核酸量等。生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、关键酶活力等。,3,三大参数从检测手段分可分为：直接参数、间接参数1、直接（状态）参数： 通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、残糖等。 直接参数在线检测参数和离线检测参数,4,1.1 在线检测参数 指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，
2、如温度、pH、搅拌转速、溶氧等。 在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控制提供依据。 由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌要求高，因此对传感器有特殊要求：,5,插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌（材料、数据） 传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染菌（密封性好） 传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号。（响应快、灵敏） 传感器性能要稳定，受气泡影响小。,6,在线检测原理：化学或物理信号 电信号 放大 记录显示仪（半自动）控制器（与设定参数比较）发出调节信号 控制器动作（全自动）,7,1.2 离线检测参数 指取出样后测定得到的参数，如
3、残糖、 NH2-N、菌体浓度。2、间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KLa等。,8,按性质：物理参数，化学参数，生物参数发酵参数在线检测直接参数按检测手段 离线检测间接参数,9,二、物理参数的测定1 温度2 空气流量3 罐压力4 搅拌转速5 黏度6 浊度,10,1温度：温度传热器一般用热电阻（铂电阻、铜电阻）放在插入发酵液的金属套管中，经过仪表进行温度的测量。 2空气流量：一般控制在0.5 1L/L.min，一般采用转子流量计测量，转子的位置随气体流量的变化而升降，造成电容量的变化，由此发出信号。（与化学参数溶氧关联） 3罐压力：发酵罐的压力可用就地指示（压力表），也可将压力信
4、号转变为电信号远传，一般采用隔膜式元件（压力敏感膜）,11,4 搅拌转速：通常以r/m表示，控制转速能调节溶氧、 CO2浓度。测速电机是安装在搅拌轴或电动机轴上的一个小型发电机，它的输出电压与转速有良好的线性关系。 （与化学参数溶氧关联）,12,5 黏度：黏度可以作为细胞生长或细胞形态的标志，也能反应发酵罐中菌丝分裂的情况，如在发酵 过程中随时测定搅拌功率的变化，也可推算出发酵液的表观黏度。 6浊度：能及时反应反应单细胞生长状况的参数，对氨基酸、核苷酸等产品的生产极为重要，目前浊度只限于取样测定，可用浊度计或分光光度计测定。,13,三、 化学参数的测定 1 pH测量 2 CO2的测量 3 溶氧
5、的测定（相对溶氧）,14,2 CO2的测量,（1）溶液中CO2的检测: CO2电极,测量CO2时，气体透过电极膜，CO2和水反应，达到以下平衡：,CO2+H2O HCO3-+H+,产生的氢离子引起pH的变化，就可以测出溶解CO2的浓度。,15,(2) 尾气CO2的测量,常用的尾气测定仪是红外线二氧化碳测定仪（简称IR），其精度高，可达 0.5%，量程的线性范围大，虽然仪器价格高，但在生物细胞培养时常被采用。 红外线CO2气体分析原理是：除了单原子气体（如氖、氩等）和无极性的双原子气体（如氧、氢、氮等）外，几乎所有气体都在红外波段（即微米级）具有不同的红外吸收光谱，CO2的红外吸收峰在2.62.
6、9m和4.14.5m之间有两个吸收峰，根据吸收峰值可以求出CO2的所含浓度。,16,三、 化学参数的测定 溶氧的测定（相对溶氧）,现在国内外测定溶液中的溶解氧基本上用复膜溶氧电极。 1 电极的构造： 由半透膜和电极两部分组成，所有的薄膜要求能透过氧分子，但不能透过电解质和水，同时要能耐高温。一般使用聚四氟乙烯、氟化乙烯-丙烯共聚物或聚丙烯薄膜，也可用硅橡胶膜。,17,复膜氧电极的结构,在阴极银（铂）片的前面包一张半透膜，氧可以透过半透膜达到阴极上进行电极反应。该半透膜固定在阴极表面。,18,19,2 复膜氧电极的工作原理,电极部分包括阳极、阴极、电解液，阴极由铂、银、金等贵金属组成，用于还原氧
7、分子，贵金属起传递电子的作用。阳极由铅、锡、铝等组成 。溶液中的氧就在阴极被还原。当产生的电流与溶液中氧含量成正比时，此时的电极电流为饱和电流。氧浓度与饱和电流成正比关系。,20,在阴极表面发生的电极反应： O2+2H2O+4e- 4OH-,阳极上的反应是：,Pb Pb2+ +2e-电极反应： Pb+O2+2H2O 2 Pb(OH)2于是在二电极之间形成电流，将氧的信号转变成电信 号。氧浓度越高，电流越大。,化学信号转变成电信号,21,溶氧电极可分为原电池型和电解型（极谱型）。 原电池型 简单便宜，不需要外加电压就有电流产生。电解型（极谱型 ）： 所用的参比电极（阳极:银构成）的电位比阴极(白
8、金或金构成)的高或相等，需极化电压使之维持在-0.6-0.8V的氧极谱电压内。,22,3 电极的标定,一般测定中应进行以下二点标定,（1）零点标定,用饱和Na2SO3作无氧状态的溶液，将氧电极放入该溶液中，显示仪表上可见溶氧浓度下降，待下降稳定后，调节零点旋钮显示零值。,（2）饱和校正（满刻度）,进行简便测定时，可以采取空气饱和方式。将电极放入培养液中，通气搅拌一段时间，显示仪上可见溶氧上升，待上升稳定，调节满刻度旋钮至100%即为饱和值。,23,四、发酵过程的中间体分析1.1 pH 1.2 糖含量 1.3 氨基氮和氨氮 1.4 磷含量 1.5 菌浓度和菌形态 1.6 产物浓度,24,抗生素效
9、价的表示,抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，效价大小用单位（U）来表示,1.6 产物浓度,25,以最低抑菌浓度(50ml肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株发育的最小青霉素剂量）为一个单位，如青霉素0.6微克1U,如链霉素、卡那霉素、红霉素单位：规定某些抗生素活性部分1g=1u等定义活性部分1g1u,26,生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准，其原理恰好与临床应用的要求相一致，而且此法灵敏度高，需用的检品量较小。但此法得到结果比较慢，需经过1618小时培养。生物法常用于发酵终了产品效价的测定。,生物法测定抗生素效价,27,常用的生物法测定抗生素，采用杯碟法,“杯”是放被测抗生素的
10、不锈钢小管，小管内径为6mm，高10mm的圆筒形管子，管子的重量尽可能相等。碟是摊布培养基的玻璃培养皿。 操作方法是：将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每碟15ml（下层），待其凝固。此外，将融化的培养基冷却到500C左右混入试验菌，将混有菌的培养基5 ml加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。,28,在培养基表面垂直放上小杯，在杯中加入待检样品，加满后在370C培养1618小时。在培养中,一方面试验菌开始生长另一方面抗生素呈球面扩散，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。随着抗生素浓度减小，有一条最低抑菌浓度带，在带范围内，菌不能生长，而呈透明的圆圈，这就叫“抑菌圈
11、”。抗生素浓度越高，抑菌圈越大，,29,r: 抑菌圈的半径(毫米） M：抗生素在管中的量（单位） C：最低抑菌浓度（单位/毫升） H：培养基的厚度（毫米） L：管子的高度（毫米） D：抗生素的扩散系数（毫米/小时） T：细菌生长到肉眼所用的时间 （小时）,30,具体测定方法：a.标准曲线的制作 假设选用的抗生素标准品浓度为：3U，4U，5U，6U, 7U 中心点是5U,31,每个浓度做三个碟子。 5U为中心点，每个碟子中有3个杯中加中心点浓度，其余3个加其它浓度。测得抑菌圈后，将浓度和抑菌圈平均直径校正后做标准曲线。,32,共获得5U的总标准样45杯，其他各浓度的5U样9杯，分别算得总标准样r1及其他各浓度的9杯的r2，r1与r2的差数及分别是各组的校正数。各浓度的9杯r平均值加校正数后制标准曲线。,33,logM,r,34,b.样品的测定： 将标准曲线实验中的中心点保留，另外的三杯（管）换成样品，校正后查表即可。,
