1、实验二十一 质粒 DNA 的提取、酶切与鉴定一、质粒 DNA 的提取原理 分离质粒 DNA 的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒 DNA。本实验采用碱变性法抽提质粒 DNA，是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。在 pH 高达 12.6 的碱性条件下，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒 DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以 pH4.8 的醋酸钾高盐缓冲液去调节其 pH 至中性时，变性的质粒 DNA 又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体 DNA 不能复性而形成缠
2、连的网状结构，通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子 RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。试剂1.溶液 I：50mmol/L 葡萄糖、10mmol/L EDTA、25mmol/L Tris-HCl pH8.0;用前加溶菌酶 4mg/ml。2.溶液 II：200mmol/L NaOH 、1% SDS。3.溶液 III：pH4.8 醋酸钾缓冲液 （ 60 ml 5mol/L 醋酸钾、 11.5ml 冰醋酸、28.5ml蒸馏水）4.TE 缓冲液 pH8.0 5.含 RNaseA 的 TE 缓冲液：TE 缓冲液含 20g/ml RNaseA。6.苯酚：氯仿（1：1，v/v）：酚需在
3、 160重蒸，加入抗氧化剂 8-羟基喹啉，使体积分数为 0.1%，并用 Tris-HCl 缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇为 24：1（v/v） 。7.1LB 溶液8.100g/ml 氨苄青霉素器材1.TGL-16 型台式高速离心机2.1.5ml 塑料离心管3.离心管架4.微量移液器5.常用玻璃器皿操作步骤1.培养细菌 将带有质粒 pUC19 的大肠杆菌接种于 5ml 含 100g/ml 氨苄青霉素的 1LB 中，37培养过夜。2.取液体培养菌液 1.5ml 置塑料离心管中，10 000r/min 离心 lmin，去掉上清液。加入 150l 溶液 I，充分混匀，在室温下放置 10
4、min。3.加入 200l 新配制的溶液 II，加盖后温和颠倒 510 次，使之混匀，冰上放置2min。4.加入 150l 冰冷的溶液 III，加盖后温和颠倒 510 次，使之混匀，冰上放置10min。5.用台式高速离心机，10 000r/min 离心 5min，将上清液移入干净的离心管中。6.向上清液中加入等体积酚/氯仿（1：1，v/v） ，振荡混匀，转速 10 000r/min，离心 2min，将上清液转移至新的离心管中。7.向上清液加 5mol/LNaCl 至终浓度为 0.3mol/L，混匀，再加入 2 倍体积无水乙醇，混匀，室温放置 2min，离心 5min，倒去上清乙醇溶液，把离心管
5、倒扣在吸水纸上，吸干液体。8.加 0.5ml 70%乙醇，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥。9.加入 50l 含 RNase A 20g/ml 的 TE 缓冲液溶解提取物，室温放置 30min 以上，使 DNA 充分溶解待用或置-20备用。二、质粒 DNA 的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定原理 限制性内切核酸酶（也可称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和 DNA 甲基化酶（修饰作用） 。它们对 DNA 底物有相同的识别顺序，但生物功能却相反。型限制性内切酶，具有能够识别双链 DNA 分子上的特异
6、核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断 DNA 的双链，形成一定长度和顺序的 DNA 片段。限制性内切酶对环状质粒 DNA 有多少切口，就能产生多少个酶解片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子质量的线状 DNA 为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出大分子形状相同的未知 DNA 的相对分子质量。试剂1. EcoR I 酶解反应液（ 10）: 1mol/L pH7.5 Tris-HCl , 0.5mol/L NaCl , 0.1mol/L MgCl2 。2.Hind III 酶解反应液
7、（10）：1mol/L pH7.4 Tris-HCl , 1mol/L NaCl , 0.07mol/L MgCl2 。3.50TAE 电泳缓冲液：称取 242 克 Tris，加入 57.1ml 冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA，调节 pH 至 8.0，加蒸馏水至 1000ml。4.凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青 FF、40%蔗糖水溶液（w/v） 。5.1%琼脂糖凝胶：1TAE 100ml 含 1g 琼脂糖。6.pUC19 质粒器材 1. 电泳仪2. 电泳槽3. 样品槽模板（梳子）4. 锥型瓶（100ml 或 50ml）5. 紫外灯6. 一次性塑料手套7.
8、凝胶成像系统操作步骤1. 质粒 DNA 的酶解 将上一实验纯化的并经自然干燥的自制 pUC19 质粒加 30l TE 缓冲液，使 DNA 完全溶解。在清洁、干燥、灭菌的塑料离心管，按下列顺序加试剂10酶解反应液 2lpUC19 10lEcoR I 1lHind III 1lH2O 6l加样后，小心混匀，置于 37水浴中，酶解 23h，然后向管子中加入 1/10体积的酶反应终止液，混匀以终止酶解反应。2. 琼脂糖凝胶电泳（1）琼脂糖凝胶的制备：称取 1g 琼脂糖，置于锥形瓶中，加入 100ml 1TAE，加热溶解，待其冷却至 65左右，小心地将其倒在有机玻璃内槽上。室温下静置 3060min，待凝固完全后，轻轻拔出样品梳，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。（3）加样用微量移液器将上述样品分别加入胶板的样品槽内。（4）电泳加完样品后的凝胶立即通电，进行电泳。样品进胶前，应使电流控制在10mA，样品进胶后电流为 20mA 左右。当溴酚蓝染料移动到距离板下沿约 2cm处停止电泳。（5）观察和拍照在波长为 245nm 的紫外光下，观察染色后的凝胶。 DNA 存在处应显示出清晰的橙红色荧光条带，用凝胶成像系统摄下。
