1、1第四章 微生物的生理第一节 微生物的酶【目的与要求】1、叙述酶的基本概念、化学本质及酶促反应特点。2、熟记酶组成、结构有关的基本概念如酶蛋白、辅助因子（辅酶、辅基）、全酶、活性中心和必需基团等。结合结构与功能的关系，论述酶原激活的化学本质。以乳酸脱氢酶为例描述同工酶的概念。3、列举酶促反应机理学说及要点。4、熟记影响酶促反应动力学的几种因素及其动力学特点。默写米氏方程，解释米氏常数，学会运用米氏方程进行简单计算。5、叙述别构酶概念、酶促反应影响因素6、知道酶的命名与分类原则。一、酶的化学本质 概念 是一类生物催化剂。化学本质 绝大多数酶是蛋白质，某些 RNA 或 DNA 也具有催化活性。 二
2、、酶催化反应的特点 遵循一般催化剂共同性质催化热力学上能进行的反应，但不能产生新反应；可加速达到平衡点，但不能改变一个反应的平衡点。特异性强一种酶只能催化一种或一类化合物或化学键，进行一定的化学反应，产生一定的产物。绝对特异性 只能作用于一种化合物，催化一种反应。相对特异性 催化一类化合物或化学键。立体异构特异性 如 L-乳酸脱氢酶只能催化 L-乳酸脱氢但不能催化 D-乳酸脱氢。所以，酶是一类具有催化反应高效率、高特异性的生物催化剂。2三、酶的化学组成辅助因子 辅基 辅酶小分子有机化合物、金属离子，直接参加反应。酶蛋白 决定反应特异性。一种辅助因子可与多种酶蛋白结合；一种酶蛋白只能与一种辅助因
3、子结合。四、酶的活性中心必需基团 酶分子中与催化作用直接相关、不可缺少的化学基团。活性中心 酶分子中必需基团相对集中，构成一定空间结构区域，与催化作用直接相关。酶原与酶原激活 无活性的酶前身物称酶原。由无活性酶原转变为有活性酶的过程称酶原激活。同工酶 分子结构不同、理化性质也不同，但催化同一化学反应的一组酶，如乳酸脱氢酶（LDH）。别位酶 多亚基组成，其中有催化亚基、有调节亚基，小分子化合物结合调节亚基后分子构象改变，引起催化活性改变。五、反应速度的影响因素1.作用物浓度对当其它条件在最适、不变情况下 S较低时,v 与 S 呈正比,即呈直线关系。 当S增加至一定程度时,v 随S增加而提高，但不
4、呈直线关系。 S再增加，v 达到最大 VMAX。米氏方程米氏常数(Km)概念3米氏常数即为反应速度达到最大反应速度一半时的作用物浓度。它是酶的特征性常数，表示酶与作用物的亲和力大小。Km 越大，酶与作用物的亲和力越小。同工酶的 Km 不同。米氏方程应用酶的鉴定-根据 Km 相同与否判定是否同一个酶。酶的纯化-根据 Km 稳定与否判定酶是否被纯化。计算欲使反应速度达到某一特定反应速度时的合理S。2.酶浓度对反应速度的影响S足够大时 vE 如图所示3.温度对反应速度的影响如图所示最适温度一般在 37-40；但 Sma 为 30，Taq DNA Pol 70。4.pH 对反应速度的影响胃蛋白酶的最适
5、 pH1.5，精氨酸酶则为 9.0。5.抑制剂对反应速度的影响抑制剂的概念及抑制种类凡能降低或停止酶反应，而本身不引起酶蛋白变性的物质，称为抑制剂。不可逆性抑制有机磷农药中毒 如 605、敌百虫、DDV 等。这类抑制剂与酶活性中心的内、外的必需基团形成牢固不可逆的共价结合。重金属和砷制剂与巯基酶结合，故可用 BAL（二巯基丙醇）急救。4可逆性抑制1）竞争性抑制特点：I 与 S 结构相似，与 S 竞争结合 E 的同一部位。抑制程度取决于I/S值。动力学特点：V MAX不变，Km 增加 如图所示2）非竞争性抑制特点：I 与 S 结构不相似，结合酶部位与 S 不同，与酶活性中心外必需基团结合，引起酶
6、构象改变。抑制程度只与I有关。动力学特点：V MAX减小，Km 不变 如图所示7.激动剂对酶反应速度的影响凡能使酶活性增强的物质 如金属离子、氯离子等称为激动剂。5第二节 微生物的营养一、目的要求掌握微生物细胞的组成、营养类型、物质进入细胞的方式及及培养基的配制。二、教学内容1微生物的营养要素2微生物的营养类型3营养物质进入细胞的方式4培养基三、重点内容微生物的营养类型以及配制培养基的原则四、教学方法利用多媒体进行教学。微生物同其他生物一样，为了生存必须从环境中吸收营养物质，通过新陈代谢将其转化成自身的细胞物质或代谢物，并从中获取生命活动所需要的能量，同时将代谢活动产生的废物排出体外。那些能够
7、满足机体生长、繁殖和完成各种生理活动所需要的物质称为营养物质。微生物获得和利用营养物质的过程称为营养。营养物质是微生物生存的物质基础，而营养是微生物维持和延续其生命形式的一种生理过程。一、 微生物细胞的化学组成1化学元素（chemical element）构成微生物细胞的物质基础是各种化学元素。根据微生物对各类化学元素需要量的大小,可将它们分为主要元素和微量元素,主要元素包括碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、铁等，碳、氢、氧、氮、磷、硫这六种主要元素可占细菌细胞干重的 97%。微量元素包括锌、锰、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。组成微生物细胞的各类化学元素的比例常因微生物种类的不同而各异。
8、不仅如此，微生物细胞的化学元素组成也常随菌龄及培养条件的不同而在一定范围内发生变化，幼龄的比老龄的含氮量高，在氮源丰富的培养基生长的细胞比在氮源相对贫乏的培养基上生长的细胞含量高。62. 化学成分及其分析各种化学元素主要以有机物、无机物和水的形式存在于细胞中。有机物主要包括蛋白质、糖、脂、核酸、维生素以及它们的降解产物和一些代谢产物等物质。对细胞有机物成分的分析通常采用两种方式：一是用化学方法直接抽提细胞内的各种有机成分，然后加以定性和定量分析；二是先将细胞破碎，然后获得不同的亚显微结构，再分析这些结构的化学成分。无机物是指与有机物相结构或单独存在于细胞中的无机盐(inorganic salt
9、)等物质。分析细胞无机成分时一般将干细胞在高温炉（550）中焚烧成灰，所得的灰分物质是各种无机元素的氧化物，称为灰分(ash constituent)。采用无机化学常规分析法可定性定量分析出灰分中各种无机元素的含量。水是细胞维持正常生命活动所不可少的，一般可占细胞重量的 70%-90%。细胞湿重(wet weight)与干重(dry weight)之差为细胞含水量，常以百分率表示。将细胞表面所吸附的水分除去后称量所得重量即为湿重，一般以单位培养液中所含细胞重量表示（g/L 或 mg/ml） ，但具体测量过程中，常由于细胞表面吸附水分除去程度的不同而导致测量结果有误差，聚集在一起的单细胞微生物表
10、面吸附的水分难以除去，这些吸附的水分可占湿重的 10%。采用高温（105）烘干、低温真空干燥和红外线快速烘干等方法将细胞干燥至恒重即为干重。值得注意的是：高温烘干会导致细胞物质分解，而利用后两种方法所得结果较为可靠。二、微生物的营养要素及营养类型（一）微生物的营养微生物生长所需要的元素主要以相应的有机物与无机物的形式提供的，也有小部分可以由分子态的气体物质提供。营养物质按照它们在机体中的生理作用不同，可以将它们区分成碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水。1. 碳源 在微生物生长过程中能为微生物提供碳素来源的物质称为碳源。碳源物质在细胞内经过一系列复杂的化学变化后成为微生物自身的细胞物质（如糖
11、类、脂类、蛋白质等）和代谢产物，碳可占一般细菌细胞干重的一半。同时绝大部分碳源物质在细胞内生化反应过程中还能为机体提供维持生命活动所需的能源，因此碳源物质通常也是能源物质。但有些 CO2作为唯一或主要碳源的微生物生长所需的能源则并非来自碳源物质。微生物利用碳源物质具有选择性，糖类是一般微生物较容易利用的良好碳源和能源物质，但不同微生物对不同糖类物质的利用也有差别，例如在以葡萄糖和半乳糖为碳源的培养基中，大肠杆菌首先利用葡萄糖，然后利用半乳糖，前者称为大肠杆菌的速效碳源，后者称为迟效碳源。目前在微生物工业发酵中7所利用的碳源物质主要是单糖、糖蜜、淀粉、麸皮、米糠等。为了节约粮食，人们已经开展了代
12、粮发酵的科学研究，以自然界中广泛存在的纤维素作为碳源和能源物质来培养微生物。不同种类微生物利用碳源物质的能力也有差别。有的微生物能广泛利用各种类型的碳源物质，而有些微生物可利用的碳源物质则比较少，例如假单胞菌属中的某些种可以利用多达 90 种以上的碳源物质，而一些甲基营养型微生物只能利用甲醇或甲烷等一碳化合物作为碳源物质。微生物利用的碳源物质主要有糖类、有机酸、醇、脂类、烃、CO 2及碳酸盐等。对于为数众多的化能异养微生物来说，碳源是兼有能源功能营养物。 2.氮源 凡是能被用来构成菌体物质中或代谢产物中氮素来源的营养物质称为氮源。氮对微生物的生长发育有重要的作用，它们主要用来合成细胞中的含氮物
13、质，一般不作为能量。只有少数细菌如硝化细菌能利用銨盐、硝酸盐作为氮源和能源。能被微生物利用的氮源物质包括蛋白质及其不同程度的降解产物（胨、肽、氨基酸等） 、铵盐、硝酸盐、分子氮、嘌呤、嘧啶、脲、胺、酰胺、氰化物等。常用的蛋白质类氮源包括蛋白胨、鱼粉、蚕蛹、黄豆饼粉、玉米浆、牛肉浸膏、酵母浸膏等。微生物对这类氮源的利用具有选择性。为避免培养基 PH 变化对微生物生长造成影响，需要在培养基中加入缓冲物质。3能源 能为微生物的生命活动提供最初能量来源营养物或辐射能。化能异养微生物的能源就是碳源，葡萄糖便是常见的一种兼有碳源与能源功能的双功能营养物。所有真菌、放线菌和大部分细菌是化能异养型微生物。化能
14、自养微生物的能源主要是无机物，这些微生物都是细菌、硝化细菌、硫细菌、氢细菌等。光能自养和异养微生物的能源主要是太阳能，如蓝细菌、紫色非硫细菌等。4生长因子 通常指那些微生物生长所必需而且需要量很小，但微生物自身不能合成的或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物。5无机盐 矿质元素也是微生物生长所不可缺少的营养物质，它们具有以下作用：参加微生物中氨基酸和酶的组成。调节微生物的原生质胶体状态，维持细胞的渗透与平衡。酶的激活剂。 根据微生物对矿质元素需要量大小可以把它分成大量元素和微量元素。大量元素：Na、K、Mg、Ca、S、P 等。微量元素是指那些在微生物生长过程中起重要作用，而机体对这些元素的
15、需要量极其微小的元素，通常需要量在 10-6-10-8mol/L：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。它们一般参与酶的组成或使酶活化（见下表） 。元 素 生 理 功 能8锌 存在于乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、RNA 与 DNA 聚合酶中硒 存在于甘氨酸还原酶、甲酸脱氢酶中铜 存在于谷氨酸变位酶中锰 存在于过氧化物歧化酶、柠檬酸合成酶中6水 是微生物生长所必不可少的，水在细胞中的生理功能主要有起到溶剂与运输介质的作用，营养物质的吸收与代谢产物的分泌必须以水为介质才能完成；参与细胞内一系列化学反应；维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象；因为水的比热高，是热的良好导体，能有效地吸收代谢过
16、程中产生的热并及时地将热迅速散发出体外，大而有效地控制细胞内温度的变化；通过水合作用与脱水作用控制由多亚基组成的结构，如微管、鞭毛的组装与解离。 微生物生长的环境中水的有效性常以水活度值 aw表示，水活度值是指在一定的温度和压力条件下，溶液的蒸气压力与同样条件下纯水蒸气压力之比。纯水 aw为 1，溶液中溶质越多，a w越小。微生物一般在 aw为 0.69-0.99 的条件下生长，a w过低时，微生物生长的迟缓期延长。（二）微生物的营养类型由于微生物种类繁多，其营养类型（nutritional）比较复杂，人们常在不同层次上和侧重点上对微生物营养类型进行划分。划分依据 营养类型 特点碳源 自养型异
17、养型 以 CO2 为唯一或主要碳源以有机物为碳源能源 光能营养型化能营养型 以光为能源以有机物氧化释放的化学能为能源电子供体 无机营养型有机营养型 以还原性无机物为电子供体以有机物为电子供体根据碳源、能源及电子供体性质的不同，可将绝大多数微生物分为光能无机自养型(photolithoautotrphy)、光能有机异养型(photoorganoheterotrphy)、化能无机自养型(chemolithoautotrphy)、化能有机自养型(chemoorganoheterotrophy)四种类型。营养类型 电子供体 碳源 能源 举例光能自养型 H2、H 2S、S、H 2O CO2 光能 蓝细菌
18、、藻类光能异养型 有机物 有机 物 光能 红螺细菌化能自养型 H2、 H2S、NH 3、 NO2- CO2 化学能 氢细菌、硫杆菌、9、 Fe2+ （无机物氧化） 硝化杆菌等化能异养型 有机物 有机 物化学能（有机物氧化） 全部真核微生物、 绝大多数细菌必须明确，无论那种分类方式，不同营养类型之间的界限并非绝对的，异养型微生物并非不能利用 CO2 ，只是不能以 CO2 为唯一或主要碳源进行生长，而且在有机物存在的情况下也可将 CO2 同化为细胞物质。同样，自养型微生物也并非不能利用有机物进行生长。另外，有些微生物在不同生长条件下生长时，其营养类型也会发生改变，例如紫色非硫细菌在没有有机物时可以
19、同化 CO2 ，为自养型微生物，而当有机物存在时，它又可以利用有机物进行生长，此时它为异养型微生物。再如紫色非硫细菌在光照和厌氧条件下可利用光能生长，为光能营养型微生物，而在黑暗与好氧条件下，依靠有机物氧化产生的化学能生长，则为化能营养型微生物。微生物类型的可变性无疑有利于提高微生物对环境条件的适应能力。三、营养物质进入细胞的方式微生物没有专门摄取营养物质的器官，它们摄取营养是依靠整个细胞表面进行的。目前认为：各种营养物质的吸收是依靠于细胞质膜的作用，细胞质膜上面有许多小孔，各种营养物质是通过不同的吸收方式透过细胞膜的。营养物质能否进入细胞取决于三个方面的因素：营养物质本身的性质（相对分子量、
20、质量、溶解性、电负性等） ；微生物所处的环境（温度、PH 等） ；微生物细胞的透过屏障（原生质膜、细胞壁、荚膜等） 。根据物质运输过程的特点，可将物质的运输方式分为自由扩散、促进扩散、主动运输、基团转移。1.自由扩散自由扩散也称单纯扩散。原生质膜是一种半透性膜，营养物质通过原生质膜上的小孔，由高浓度的胞外环境向低浓度的胞内进行扩散。自由扩散是非特异性的，但原生质膜上的含水小孔的大小和形状对参与扩散的营养物质分子有一定的选择性。它有以下特点：物质在扩散过程中没有发生任何反应；不消耗能量；不能逆浓度运输；运输速率与膜内外物质的浓度差成正比。自由扩散不是微生物细胞吸收营养物的主要方式，水是唯一可以通
21、过扩散自由通过原生质膜的分子，脂肪酸、乙醇、甘油、一些气体（O 2、CO 2）及某些氨基酸在一定程度上也可通过自由扩散进出细胞。2.促进扩散与自由扩散一样，促进扩散也是一种被动的物质跨膜运输方式，在这个过10程中不消耗能量，参与运输的物质本身的分子结构不发生变化，不能进行逆浓度运输，运输速率与膜内外物质的浓度差成正比。需要载体参与。通过促进扩散进入细胞的营养物质主要有氨基酸、单糖、维生素及无机盐等。一般微生物通过专一的载体蛋白运输相应的物质，但也有微生物对同一物质的运输由一种以上的载体蛋白来完成。3.主动运输主动运输是广泛存在于微生物中的一种主要的物质运输方式。与上面两种运输相比它的一个重要特
22、点是物质运输过程中需要消耗能量，而且可以进行逆浓度运输。在主动运输过程中，运输物质所需要的能量来源因微生物不同而不同，好氧型微生物与兼性厌氧微生物直接利用呼吸能，厌氧微生物利用化学能，光合微生物利用光能。主动运输与促进扩散类似之处在于物质运输过程中同样需要载体蛋白，载体蛋白通过构象变化而发迹与被运输物质之间的亲和力大小，使两者之间发生可逆性结合与分离，从而完成相应物质的跨膜运输，区别在于主动运输过程中的载体蛋白构象变化需要消耗能量。4.基团移位基团移位是另一种类型的主动运输，它与主动运输方式的不同之处在于它有一个复杂的运输系统来完成物质的运输，而物质在运输过程中发生化学变化。基团转移主要存在于
23、厌氧型和兼性厌氧型细胞中，主要用于糖的运输，脂肪酸、核苷、碱基等也可以通过这种方式运输。在研究大肠杆菌对葡萄糖和金黄色葡萄糖对乳糖的吸收过程中，发现这些糖进入细胞后以磷酸糖的形式存在于细胞质中，表明这些糖在运输过程中发生了磷酸化作用，其中的磷酸基团来源于胞内的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP） ，因此也将基团转位称为磷酸烯醇式丙酮酸-磷酸糖转移酶运输系统（PTS） ，PTS 通常由五种蛋白质组成，包括酶 I、酶 II、和一种低相对分子量的热稳定蛋白质（HPr） 。在糖的运输过程中，PEP 上的磷酸基团逐步通过酶 I、HPr 的磷酸化与去磷酸化作用，最终在酶 II 的作用下转移到糖，生成磷酸糖放于细胞质
24、中。PEP-P + HPr HPr-p + 酶 I 酶 I + 丙酮酸酶 I-P + HPr 酶 III + 酶 IHPr-P + 酶 III 酶 III-P + HPr 糖 + 酶 III-P 糖-P + 酶 III四种运送营养方式的比较比较项目 单纯扩散 促进扩散 主动运输 基团移位特异载体蛋白 无 有 有 有运送速度 慢 快 快 快11溶质运送方向 由浓至稀 由浓至稀 由稀至浓 由稀至浓平衡时内外浓度 内外相等 内外相等 内部高 内部高运送分子 无特异性 特异性 特异性 特异性能量消耗 不需要 需要 需要 需要运送前后溶质分子 不变 不变 不变 改变载体饱和效应 无 有 有 有与溶质类似
25、物 无竞争性 有竞争性 有竞争性 有竞争性运送抑制剂 无 有 有 有运送对象举例 水、甘油乙醇、O2、CO 2糖、SO 42-、PO 43-氨基酸、乳糖等糖类，少量无机离子葡萄糖、果糖、嘌呤、嘧啶等四、培养基培养基是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。无论是以微生物为材料的研究，还是利用微生物生产生物制品，都必须进行培养基配制，它是微生物学研究和微生物发酵生产的基础。1.配制培养基的原则1）目的明确 根据不同的微生物的营养要求配制针对强的培养基。自养型微生物能从简单的无机物合成自身需要的糖类、脂类、蛋白质、核酸、维生素等复杂的有机物，因此培养自养型微生物的培养基完全可以由简
26、单的无机物组成。如果要分离或培养某种特殊类型的微生物，还需要采用特殊的培养基，对于某些需要另外添加生长因子才能生长的微生物，还需要在培养基内添加它们所需要的生长因子。2）营养协调注意各种营养物质的浓度与配比。培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需，浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用，例如：高浓度糖物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑制或杀菌作用。另外培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累，其中碳氮比（C/N）的影响较大。碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的物质的量比值，
27、有时也指培养基中还原糖与粗蛋白之比。例如，在利用微生物发酵生产谷氨酸的过程中，培养基碳氮比为 4/1 时，菌体量繁殖，谷氨酸积累少；当培养基碳氮比为 3/1 时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。12再如，在抗生素发酵生产过程中，可以通过控制培养基中速效氮（或碳）源与迟效氮（或碳）源之间的比例来控制菌体生长与抗生素的合成协调。3）控制 PH、渗透压等条件培养基的 PH 必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适 PH 条件各不相同，一般来讲，细胞生长的最适 PH 范围在 PH7.0-8.0 之间，放线菌在 7.5-8.5之
28、间，酵母菌在 3.8-6.0 之间，而霉菌则在 4.0-5.8 之间。具体的第种微生物还有其特定的最适生长 PH 范围，但是对于某引起胡极端环境中的微生物来六，往往可以大大突破所属类群微生物 PH 范围的上限和下限。在微生物生长繁殖和代谢过程中，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累，会导致培养基 PH 发生变化，若不对培养基 PH 条件进行控制，往往导致微生物生长速度下降或代谢产物产量下降。因此为了维持培养基 PH 的相对恒定，通常在培养基中加入 PH 缓冲剂，常用的缓冲剂是 K2HPO4 KH2PO4 组成的混合物。但K2HPO4/ KH2PO4缓冲系统只能在一定的 PH 范围（PH
29、6.4-7.2）内起调节作用。有些微生物，如乳酸菌能大量产酸，此时只级在培养基加入难溶的碳酸盐（CaCO 3）来进行调节，CaCO 3难溶于水，不会使培养基 PH 过度升高，但它可以不断中和微生物产生的酸，同时释放出 CO2，将培养基 PH 控制在一定范围内。绝大多数微生物适宜在等渗溶液中生长，一般培养基的渗透压都是适合的，但培养嗜盐微生物（如嗜盐细菌）和嗜渗压微生物（如高渗酵母）时就要提高培养基的渗透压。培养嗜盐微生物常加适量 NaCl，海洋微生物的最适生长盐度约 3.5%。培养嗜渗透微生物时要加接近饱和量的蔗糖。4）经济节约在配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料为培养基成分，特别在发
30、酵工业中，培养基用量很大，利用低成本的原料更体现出其经济价值。如在微生物单细胞蛋白的工业生产中，常常用利用糖蜜、豆制品工业废液等作为培养基的原料，另外大量的农副产吕如麸皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼等都是常用的发酵工业原料。经济节约原则大致有：以粗代精、以野代家、以废代好、以简代繁、以烃代粮、以纤代糖、以氮代朊和以国（产）代进（口）等方面。2.培养基的类型及应用培养基种类繁多，根据其成分、物理状态和用途可将培养分成多种类型。1）按成分不同划分（1）天然培养基 含用化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物。牛肉膏蛋白胨培养基和麦芽汁培养基就属于此类。常用的天然有机营养物13质
31、包括牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、豆芽汁、玉米粉、牛奶等。天然培养基成本较低，除在实验室经常使用外，也适于用来进行工业大规模的微生物发酵生产。（2）合成培养基 是化学成分完全了解的物质配制而成的培养基。高氏1 号培养基和查氏培养基就属于此种类型。配制合成培养基时重复性强但与天然培养基相比其成本较高，微生物在其中生长速度较慢，一般适用于在实验室用来进行有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等方面的研究工作。2）根据物理状态划分（1）固体培养基 在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态即为固体培养基。培养基中的琼脂含量一般为 1.5%-2.0%理想的凝固剂应具有下列
32、条件：不被所培养的微生物分解利用；在微生物生长的温度范围内保持固体状态；凝固剂凝固温度不能太低，否则不利于微生物的生长；凝固剂对所培养的微生物无毒害作用；凝固剂在灭菌过程中不会被破坏；透明度好，粘着力强。常用的凝固剂有琼脂（agar） 、明胶和硅胶等。对绝大多数微生物而言，琼脂是最理想的凝固剂，琼脂是藻类（石花菜）中提取的一种高度分支的复杂多糖。除在液体培养基中加入凝固剂制备的固体培养外，一些由天然固体基质制成的培养基也属于固体培养基。如马铃薯块、胡萝卜条、米糠等制成的固体状态的培养基就属于此类。又如生产酒的酒曲，生产食用菌的棉子壳培养基。在实验室中，固体培养基一般加入平皿或试管中，制成培养微
33、生物的平板或斜面。固体培养基为微生物提供一个营养表面，单个微生物细胞在这个营养表面进行生长繁殖，可以形成单个菌落。固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏。（2）半固体培养基 半固体培养基中凝固剂的含量少比固体培养基少，培养基中琼脂含量一般为 0.2%-0.7%。半固体培养常用来观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定等。（3）液体培养基 液体培养基中未加任何凝固剂，在用液体培养基培养微生物时，通过振荡或搅拌可以增加培养基的通气量，同时使营养物质分布均匀。液体培养基常用于大规模工业生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究。3）按用途划分（1）基础培养基 尽管不
34、同微生物的营养需求不同，但大多数微生物所需的基本营养物质是相同的。基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基14本营养物质的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基。（2）加富培养基 也称为营养培养基，即在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基。这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。加富培养基一般用来培养营养要求比较苛刻的异养微生物，如培养百日咳博德氏菌需要含有血液的加富培养基。加富培养基还用来富集和分离某种微生物，这是因为加富培养基含有某种微生物所需的特殊营养物质，该种微生物在这种培养基中较其他微生物生长速度快，并逐渐富集而占优势，逐步淘汰其他微
35、生物，从而容易达到分离该种微生物的目的。（3）鉴别培养基 用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基加入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物，而这咱代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征变化，根据这种特征性变化，可将该种微生物与其他微生物区别开来。鉴别培养基主要用于微生物的快速分类鉴定，以及分离和筛选产生某种代谢产物的微生物菌种。培养基名称 加入化学物质代谢产物 培养基特征性变化 主要用途酪素培养基 酪素 胞外蛋白酶 蛋白水解圈 鉴别蛋白酶菌株H2S 试验培养基 醋酸铅 H2S 产生黑色沉淀 鉴别产 H2S 的菌株伊红美蓝培养基伊红、美蓝
36、 酸 带金属光泽紫色菌落鉴别大肠杆菌（4）选择培养基 用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。一种类型选择培养基是依据某些微生物的特殊营养需求设计的，例如，利用以纤维素或石蜡作为唯一碳源的选择培养基，可以从混杂的微生物群体中分离出分解纤维素或石蜡油的微生物；缺乏氮源的选择培养基可用来分离固氮微生物。另一类选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需分离的微生物无害，但可以抑制或杀死其他微生物。在
37、实际应用中，有时需要配制既有选择作用又有鉴别作用的培养基。如当要分离金黄色葡萄球菌时，在培养基中加入 7.5%NaCl、甘露糖醇和酸碱批示剂，金黄色葡萄球菌可耐高浓度 NaCl，且能利用甘露糖醇产酸。因此能在上述培养基生长，而且菌落周围颜色发生变化，则该菌落有可能是金黄色葡萄球菌，再15通过进一步鉴定加以确定。尽管如此，有些病毒和立克次氏体及某些螺旋体等专性活细胞寄生的微生物目前还不能利用人工培养基来培养，需要接种在动植物体内、动植物组织中才能增殖。常用的培养病毒与立克次氏体的动物有小白鼠、家鼠、豚鼠和鸡胚。思 考 题1 什么叫营养？什么是营养物？营养物有哪些生理功能？2 营养物质包括哪些？各
38、有何功能？3 根据碳源、能源及电子供体的不同可将微生物划分为几种类型？举例说明。4 营养物质进入细胞的方式有几种？各有何特点？5 什么是培养基？配制培养基时应遵循什么原则？6 培养基按化学成分、物理状态、用途来划分可分为哪几种类型？7 采用什么方法能分离到能分解并利用苯作为碳源和能源物质的细菌纯培养？8 某同学利用酪素培养基平板筛选产胞外蛋白酶细菌，在酪素培养基平板上发现有几株菌的菌落周围有蛋白水解圈，是否能仅凭蛋白水解圈与菌落直径比大，就能断定该菌株产胞外蛋白酶的能力就大，而将其选择为高产蛋白酶的菌种，为什么？16第三节 微生物的能量代谢一、目的要求掌握微生物代谢和呼吸类型，调控方式。二、教
39、学内容1微生物能量代谢2微生物独特的代谢途径3微生物代谢的调控4微生物次级代谢与次级代谢产物三、重点与难点内容微生物代谢的调节、次级代谢及产能方式。四、教学方法采用多媒体教学新陈代谢（metabolism）简称代谢，是指发生在活细胞中的各种分解代谢（catabolism）和合成代谢（anabolism）的总和。分解代谢是指复杂的有机物分子通过分解代谢酶系的催化，产生简单分子、腺苷三磷酸（ATP）形式的能量和还原力的作用；合成代谢与分解代谢正好相反，是指在合成代谢酶系的催化下，由简单小分子、ATP 形式的能量和H式的还原力一起合成复杂的大分子的过程.能量代谢的中心任务是生物体如何把外界环境中多种
40、形式的最初能源转换成对一切生命活动都能使用的通用能源ATP。对微生物来说，它们可利用的最初能源有三大类即：有机物、日光和还原态无机物。17一、异养微生物的生物氧化生物氧化是发生在活细胞内的一系列产能性氧反应的总称。生物氧化的形式包括某物质与氧结合、脱氢或失去电子；生物氧化的过程可分为脱氢（或电子） 、递氢（或电子）和受氢（或电子）三个阶段；生物氧化的功能则有产能、产还原力和产小分子中间代谢物三种。异养微生物氧化有机物的方式，根据氧化还原反应中电子受体的不同可分成发酵和呼吸两种类型，而呼吸以可分为有氧呼吸和无氧呼吸两种方式。1发酵发酵是指微生物细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完成氧化
41、的某种中间产物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物。在发酵条件下有机化合物只是部分地被氧化，因此只释放出一小部分的能量。发酵过程的氧化是与有机物的还原偶联在一起的。被还原的有机物来自于初始发酵的分解代谢，即不需要外界提供电子受体。发酵的种类有很多，可发酵的底物有糖类、有机酸、氨基酸等，其中以微生物发酵葡萄糖最为重要。生物体内葡萄糖被降解成丙酮酸的过程称为糖酵解，主要分为四种途径：EMP、HMP、ED、磷酸解酮酶途径。（1） EMP 途径整个 EMP 途径大致可分为两个阶段。第一阶段可认为是不涉及氧化还原反应及能量释放的准备阶段，只是生成两分子的主要中间代谢产物：甘油醛-3-磷酸。第二个阶段发
42、生氧化还原反应，合成 ATP 并形成两分子的丙酮酸。在糖酵解过程中，有两分子 ATP 用于糖的磷酸化，但合成出四个分子的 ATP，因此每氧化一个分子的葡萄糖净得两个 ATP。在两分子的 1，3-二磷酯甘油酸的合成过程中，两分子 NAD+被还成为NADH。然而，细胞中的 NAD+供应是有限的，假如所有的 NAD+ 都转化为 NADH，葡萄糖的氧化就得停止。因为甘油-3-磷酸的氧化反应只有在 NAD+存在时才能进行。这一路径可以通过将丙酮酸还原，使 NADH 氧化重新成为 NAD+而得以克服。例如在酵母细胞中丙酮酸被还原成为乙醇，并伴有 CO2的释放。而在乳酸菌细胞中，丙酮酸被还原成乳酸。对于原核
43、生物细胞，丙酮酸的还原途径是多样的，但有点是一致的：NADH 必须重新被还原成 NAD+，使得酵解过程中的产能反应得以进行。EMP 途径可为微生物的生理活动提供 ATP 和 NADH，其中间产物又可为微生物的合成代谢提供碳骨架，并在一定的条件下可逆转合成多糖。（2） HMPHMP 途径是从葡萄糖-6-磷酸开始的，HMP 途径的一个循环的最终结果是一18分子葡萄糖-6-磷酸转变成一分子甘油醛-3-磷酸，三分子 CO2和六分子 NADPH。一般认为 HMP 途径合成不是产能途径，而是为生物合成提供大量的还原力（NADPH）和中间代谢产物。如核酮糖-5-磷酸是合成核酸，某些辅酶及组氨酸的原料。另外
44、HMP 途径中产生的核酮糖-5-磷酸，还可以转化为核酮糖-1，5-二磷酸，在羧化酶作用下固定 CO2，对于光能自养菌、化通自养菌具有重要意义。虽然这条途径中产生的 NADPH 可经呼吸链氧化产能，1 摩尔葡萄糖经 HMP 途径最终可得到 35 摩尔 ATP，但这不是代谢中的主要方式。因此，不能把 HMP 途径看作是产生 ATP 的有效机制。大多数好氧和兼性厌氧微生物中都有 HMP 途径，而且在同一微生物中往往同时存在 EMP 和 HMP 途径，单独具有 EMP 和 HMP 途径的微生物较少见。（3） ED 途径ED 途径是在研究嗜糖假单胞菌时发现的，在 ED 途径中，葡萄糖-6-磷酸首先脱氢产
45、生葡萄糖酸-6-磷酸，接着在脱水酶和醛缩酶的作用下，产生一个分子甘油醛-3-磷酸和一个分子丙酮酸。然后甘油醛-3-磷酸进入 EMP 途径转变成丙酮酸。一分子葡萄糖经 ED 途径最后生成两分子丙酮酸、一分子 ATP、一分子NADPH 和 NADH。ED 途径在革兰代阴性菌中分布广泛，特别是假单胞菌和固氮的某些菌株较多存在。ED 途径可不依赖于 EMP 和 HMP 途径而单独存在，但对于靠底物水平磷酸化获得 ATP 的厌氧菌而言，ED 途径不如 EMP 途径。（4） 磷酸解酮酶途径磷酸解酮酶途径是明串珠菌在进行异型乳酸发酵过程中分解已糖和戊糖的途径。该途径的特征性酶是磷酸解酮酶，根据解酮酶的不同，
46、把具有磷酸戊糖解酮酶的称为 PK 途径，把具有磷酸已糖解酮酶的称为 HK 途径。在糖酵解过程中生成的丙酮酸可被进一步代谢。在无氧条件下，不同的微生物分解丙酮酸后会积累不同的代谢产物。目前发现多种微生物可以发酵葡萄糖产生乙醇，能进行乙醇发酵的微生物包括酵母菌、根霉、曲霉和某些细菌。根据在不同条件下代谢产物的不同，可将酵母菌利用葡萄糖进行的发酵分为三种类型：如果以乙醛（丙酮酸脱羧）为受体生成乙醇，这种发酵称为酵母的一型发酵；当环境中存在亚硫酸氢钠时，不能以乙醛作为受体，而以磷酸二羟丙酮作为受体时，产物为甘油，称为酵母的二型发酵；在弱碱性条件下（PH7.6） ，乙醛因得不到足够的氢而积累，两个乙醛分
47、子间会发生歧化反应，一个作为还原剂形成乙酸，一个作为氧化剂形成乙醇，受体为磷酸二羟丙酮，发酵产物为甘油、乙醇和乙酸，称为酵母的三型发酵。这种发酵方式不产生能量，只能在非生长的情况下进行。不同的细菌进行乙醇发酵时，其发酵途径也各不相同。如厌氧发酵单胞菌19是利用 ED 途径分解葡萄糖为丙酮酸，最后得到乙醇。肠杆菌则是利用 EMP 途径来进行乙醇发酵。许多细菌能利用葡萄糖产生乳酸，这类细菌称为乳酸细菌。根据产物的不同，乳酸发酵有三种类型：同型乳酸发酵（利用 EMP 途径产物只有乳酸） 、异型乳酸发酵（利用 PK 乳酸及部分乙醇或乙酸）和双歧发酵（利用双歧双歧杆菌发酵葡萄糖产生乳酸的一条途径） 。许
48、多厌氧菌可进行丙酸发酵、丙酮-丁醇发酵；某些肠杆菌可进行混合酸发酵，产物为乳酸、乙酸、甲酸、乙醇、CO 2和氢气等。2 呼吸作用微生物在降解底物的过程中，将释放出的电子交给 NAD（P） 、FAD 或 FMN等电子载体，再经电子传递系统传给外源电子受体，从而生成水或其他还原型产物并释放出能量的过程，称为呼吸作用。其中以分子氧作为最张终电子受体的称为有氧呼吸，以氧化型化合物作为最终电子受体的称为无氧呼吸。呼吸作用与发酵作用的根本区别在于：电子载体不是将电子直接传递给给底物降解的中间产物，而交给电子传递系统，逐步释放出能量后再将取终电子受体。（1） 有氧呼吸在发酵过程中，葡萄糖经过糖酵解作用形成的
49、丙酮酸在厌氧化条件下转变成不同的发酵产物，而在有氧呼吸过程中，丙酮酸进入三羧酸循环（TCA）被彻底氧化成水和 CO2，同时释放出大量能量。在 TCA 循环过程中，丙酮酸完全氧化为三个分子的 CO2，同时生成四分子的 NADH 和一分子 FADH2。NADH 和 FADH2 可以电子传递系统重新被氧化，由此每一氧化一分子 NADH 可生成三个分子 ATP，每氧化一分子 FADH2可生成两分子ATP。另外琥珀酰辅酶 A 在氧化成延胡索酸时，包含着底物水平磷酸化作用，由此产生一分子 GTP，随后 GTP 转化 ATP。因此每一次 TCA 循环可生成 15 分子ATP。此外在糖酵解过程中产生的两分子 NADH 可经电子传递链系统重新被氧化，产生 6 分子 ATP。在葡萄糖转变为两个分子丙酮酸时还可借底物水平磷酸化生成两分子 ATP。因些需氧微生物在完全氧化葡萄糖的过程中总共可得到 38 分子的 ATP。在糖酵解和三羧酸循环过程中形成的 NADH 和 FADH2通过电子传递系统被氧化，最终形成 ATP 为微生物的生命活动提供能量。电子传递系统是由一系列氢和电子传递体组成的多酶氧化还原体系。NADH、
