1、第二十一章,常用分子生物学技术的原理及应用 The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application,第 一 节 分子杂交与印迹技术 Molecular Hybridization & Blotting Technology,分子杂交特性（见第二章）探针技术印迹技术,核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 利用DNA变性与复性这一基本性质来进行DNA或RNA定性或定量分析的一种技术。,一、分子杂交与印迹技术的原理,第 二 节,聚 合 酶 链 反 应 Polymerase Cha
2、in Reaction（PCR）,一种可以将目的微量的DNA片断扩增100万倍以上的技术,(末代沙皇尼古拉二世、1918年的流行性感冒病毒、电影侏罗纪公园，以及辛普森杀妻案，这四件事情到底有什么相关？答案是没有),PCR 可以把 指定的基因片段 数量放大百万倍,染色体,Mullis (1993),（二）PCR基本反应步骤,变性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,循环 2530 次,使模板DNA完全变性成单链。同时引物自身和引物之间存在的局部双链得以消除,使引物和模板DNA退火结合,此温度下DNA聚合酶以dNTP 为底物催化DNA链的延长,三个步骤为一个循环， 每次循环产物作为下一轮模板进
3、入下一轮循环,第一轮循环,引物A,引物B,变性（95）,退火（60）,延伸（72）,DNA-Pol,DNA-Pol,温度,第二轮循环,引物A,引物B,变性（95）,退火（60）,延伸（72）,温度,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,第三次循环,变性（95）,退火（60）,延伸（72）,温度,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,第一次循环,第二次循环,第三次循环,第四次循环,四、PCR的主要用途,PCR的 用途,基因突变 分析,基因的 体外突变,目的基因 的克隆,DNA 序列
4、测定,DNA和RNA 的微量分析,1、与反转录结合，直接从组织细胞中的mRNA 获得目的基因； 2、利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得目的基因片段； 3、利用简并引物从cDNA 文库或基因组文库中获得具有一定序列相似性的基因片段； 4、利用随机引物从cDNA文库中克隆基因。,利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的DNA的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。,PCR技术高度敏感，对DNA的含量要求很低。理论上只要存在一分子的模板就可以获得目的片段。 RNA需要反转录。,利用PCR结合其它技术，可以提高基因突变检测的敏感性。,三、几种重要的PCR衍生技术,（一）反转录PCR技术
5、（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术,第 三 节,核 酸 序 列 分 析 Nucleic Acid Sequence Analysis,核酸序列分析的基本原理化学裂解法 (Maxam-Gillbert法)DNA链的末端合成终止法 (sanger法),一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法),基本原理 基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。 分析前，用同位素标记DNA的5末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列
6、。,二、DNA链末端合成终止法,又称Sanger法，其基本原理如下： 2，3-双脱氧核苷酸（ddNTP） 无3碳原子上的羟基，故不能与下位核苷酸形成磷酸二酯键。 DNA合成反应在此终止。,2，3-双脱氧核苷酸（ddNTP）,DNA-Pol dNTPs,DNA-Pol dNTPs,DNA-Pol dNTPs,DNA-Pol dNTPs,引物,待测序模板DNA,各管分别加入四种ddNTP,ddATP,ddGTP,ddTTP,ddCTP,DNA链末端合成终止法基本原理,DNA链末端合成终止法基本流程,待测DNA模板： 3TTGCACCTGA5 引物：与模板3端互补 DNA聚合酶（DNA-Pol） dNTP底物（其中一种用32P标记）四个试管中分别加入，反应一段时间。,ddG,ddA,ddT,ddC,电 泳,三、DNA自动测序,采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。 用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸； 然后进行Sanger测序反应； 反应产物经电泳（平板或毛细管电泳）分离； 通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,DNA自动测序结果举例,生物芯片技术,基因芯片技术,
