1、绿色植物中色素的 提取和分离 (薄层色谱和柱色谱),有机化学实验,返回,色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一，它的分离效果比分馏、重结晶等一般的物理方法好，适用于少量和微量物质的分离。这一方法已在化学、生物学和医学中得到了普遍应用，广泛用于天然产物的分离和提纯。,绿色植物中色素的提取和分离,实验目的实验原理试剂及仪器实验步骤注意事项,返回,一、实验目的,1.学习从植物中提取色素的方法。 2.学习薄层色谱(层析)和柱色谱(层析)的原理及其操作方法。,返回,二、实验原理,返回,叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素极性次序为何？,提问,绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素(绿)、胡萝卜素(橙)和
2、叶黄素(黄)等多种天然色素。,通过柱色谱(层析)和薄层色谱(层析)对菠菜叶中的上述几种色素进行分离。,叶绿素a(R=CH3) 叶绿素b(R=CHO),-胡萝卜素(R=H) 叶黄素(R=OH),返回,吸附色谱是以氧化铝、硅胶等为吸附剂，将一些物质从溶液中吸附到它的表面上；然后用溶剂洗脱或展开，利用不同物质在吸附剂和溶剂之间分布情况不同而得到分开。如柱色谱和薄层色谱。 分配色谱是利用混合物的组分在2种互不相溶的液体中分布情况不同而得到分离。这样的分离不经过吸附程序，仅由溶剂的萃取来完成，相当于一种连续性溶剂萃取方法。,色谱法分为吸附色谱和分配色谱2类,返回,薄层色谱,薄层色谱是一种微量、快速和简单
3、的色谱方法，用于分离、纯化和鉴定有机化合物。优点是展开时间短、分离效率高和需要样品少(几微克)，特别适用于挥发性较小，或者在较高温底下易发生变化，不宜用气相色谱分离的化合物。 薄层色谱为固液吸附色谱。样品是在薄层板上的吸附剂(固定相)和展开剂(流动相)之间进行分离。吸附剂对各种化合物的吸附能力不同，在展开剂上移时，它们进行不同程度的解吸，从而达到分离的目的。,返回,吸附剂薄层色谱中常用的吸附剂是硅胶和氧化铝。其中硅胶分为硅胶G(含有煅石膏粘合剂)、硅胶H(不含粘合剂)、硅胶HF254(含荧光物质)。氧化铝也根据含粘合剂或荧光物质分为氧化铝G、氧化铝G F254、氧化铝HF254。,展开剂薄层色
4、谱的展开剂主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性来考虑。溶剂极性越大，对化合物的洗脱力也越大。薄层色谱的展开要在密闭的容器内进行。,返回,1：薄层板为什么要活化？ 2：在混合物的薄层色谱中，如何定性的判定各组分在薄层上的位置。,返回,提问,薄层色谱的展开,Rf值(比迁移值)比迁移值是表示色谱图上斑点相对位置的一个数值。各种物质的Rf值因其结构、吸附剂种类、展开剂、温度等不同而异。当上述条件固定时，对于一个物质来说比迁移值(Rf值)是一个特性常数，可以用来鉴别不同化合物，还可用于物质的分离和定量测定。,返回,柱色谱是通过色谱柱来实现分离的。在色谱柱内装有固体吸附剂(固定相)如氧化铝或硅胶。液体
5、样品从柱顶加入，当液体流经吸附剂时，由于吸附剂表面对液体中各组分吸附能力不同而按一定的顺序吸附。然后从柱顶加入洗脱剂(流动相)，样品中的各组分随洗脱剂按一定的顺序从色谱柱下端流出，根据不同颜色分段收集。如为无色物质，可用紫外光照射，收集会发出荧光的组分；否则就要采取分段收集洗提液，再分别进行鉴定。,柱色谱,返回,柱色谱原理：,混合物,洗脱剂,返回,吸附剂常用吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁等。吸附剂对化合物的吸附能力与分子的极性有关，极性越强，吸附能力越大，分子中含有极性较大的基团，其吸附能力也越强。,酸、碱醇、胺、硫醇酯、醛、酮 芳香族化合物卤代物、醚烯烃饱和烃,氧化铝对下列化合物的吸附性：,返
6、回,溶剂溶剂分为溶解样品的溶剂和洗脱剂。选择溶剂时还要考虑到被分离物各组分的极性和溶解度。通常是先将要分离的样品溶于非极性溶剂中，从柱顶加入柱中。然后用稍大极性的溶剂使各组分在柱中形成若干谱带。再用极性更大的溶剂洗脱被吸附的物质。为了提高洗脱效果，有时也使用混合溶剂。,溶剂的洗脱能力按下列次序递增： 石油醚、四氯化碳、甲苯、苯、二氯甲烷、 氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、丙醇、乙醇、 甲醇、水、吡啶、乙酸。,返回,三、试剂及仪器,返回,硅胶G 中性氧化铝 (100200目) 羧甲基纤维素 甲醇 石油醚(6090) 丙酮 乙酸乙酯 无水硫酸钠,试剂：,仪器：,半微量有机合成玻璃仪器； 色谱柱； 层析
7、缸； 旋转蒸发仪,四、实验步骤,返回,1. 菠菜色素的提取：把新鲜菠菜洗净晾干或用滤纸吸干，称取10g菠菜叶，剪碎后放入研钵，再加入10mL甲醇。研磨后抽滤，弃去滤液。将菜渣和菜叶放回研钵，用10mL石油醚-甲醇(3：2体积比)混合液萃取次，每次需研磨并且抽滤。把两次滤液合并，转入分液漏斗中。用5mL水洗涤两次，弃去水-甲醇层。石油醚层转入干燥的锥瓶中用无水硫酸钠干燥。干燥后的液体在旋转蒸发仪上蒸除乙醚至体积约1mL左右。,四、实验步骤,返回,2. 薄层色谱分析： (1) 将1.5g硅胶G和4mL0.5%CMC水溶液，调匀后制成薄板4块。晾干后于110活化1h。 (2) 点样。 (3) 展开*
8、。 (4) 计算Rf值。,展开剂分别为： a.石油醚-丙酮(8：2体积比)混合液 B.石油醚-乙酸乙酯(6：4体积比)混合液,四、实验步骤,返回,3. 柱色谱分离色素： (1) 用10g中性氧化铝和石油醚装层析柱。 (2) 将菠菜色素浓溶液用滴管小心加到层析柱顶部。加完后打开下部活塞，让液面下降到柱面以下1mm左右关闭活塞。加入数滴石油醚，重新打开活塞使液面下降，重复几次使有色物质全部进入柱体内。 (3) 依次用不同洗脱剂进行洗脱，收集各色带。,各洗脱剂对应的色带,石油醚-丙酮(9:1体积比)混合液胡萝卜素(橙黄色),石油醚-丙酮(7:3体积比)混合液叶黄素(黄色),丁醇-乙醚-水(3:1:1体积比)混合液 叶绿素a(蓝绿色)和叶绿素b(黄绿色),返回,五、注意事项,返回,1. 甲醇有毒，请在通风良好处使用； 2. 柱中不可有空气，必要时用装在玻棒上的橡皮塞轻轻敲击柱身； 3. 柱中氧化铝表面任何时候都不得露出液面，以防有空气进入； 4. 待色素全部进入柱体后，方可进行洗脱，以防有拖尾影响分离效果。,
