1、中 国 药 理 学 与 毒 理 学 杂 志 2 0 2 3 年 9 月 第 3 7 卷 第 9 期 C h i n J P h a r m a c o l T o x i c o l，V o l 3 7，N o 9，S e p 2 0 2 3m i R-2 1-5 p 靶 向 J A K/S T A T 信 号 通 路 抑 制 T h 1 细 胞 极 化李 露1，2，李 雪2，孟 广 雨1，2，刘 元 林2，王 洋2，吴 楚 姗1，2，许 婷 婷1，2，白 海 涛2，袁 福 临2，郑 荣 秀1，张 毅2（1.天 津 医 科 大 学 总 医 院 儿 科，天 津 3 0 0 0 5 2；2.军 事
2、 科 学 院 军 事 医 学 研 究 院 辐 射 医 学 研 究 所，北 京 1 0 0 8 5 0）摘 要：目 的 探 讨 m i R-2 1-5 p 对 1 型 辅 助 性 T 细 胞（T h 1 细 胞）极 化 相 关 信 号 通 路 的 调 控 作 用。方 法 提取 小 鼠 脾 单 个 核 细 胞，用 免 疫 磁 珠 阴 性 分 选 试 剂 盒 分 离 初 始（n a v e）C D 4+T 细 胞，用 抗 小 鼠 C D 3，C D 2 8 和白 细 胞 介 素 4（I L-4）单 克 隆 抗 体 及 小 鼠 I L-1 2 和 I L-2 混 合 因 子 诱 导 体 系 诱 导 初
3、 始 C D 4+T 细 胞 向 T h 1 细 胞 极化，同 时 转 染 m i R-2 1-5 p 模 拟 物 或 模 拟 物 对 照，分 别 命 名 为 T h 1 诱 导 组、诱 导+模 拟 物 对 照 组 和 诱 导+m i R-2 1-5 p 模 拟 物 组，7 2 h 后 用 流 式 细 胞 术 检 测 C D 4 和 干 扰 素（I F N-）双 阳 性（C D 4+I F N-+）细 胞 百 分比；用 实 时 荧 光 定 量 P C R（R T-q P C R）检 测 T h 1 细 胞 极 化 相 关 关 键 转 录 因 子 和 细 胞 因 子 m R N A 表 达 水
4、平；W e s t e r n 印 迹 法 检 测 T h 1 细 胞 极 化 相 关 通 路 关 键 蛋 白 及 其 磷 酸 化 水 平。结 合 双 荧 光 素 酶 报 告 系 统 验 证m i R-2 1-5 p 作 用 靶 标 关 键 细 胞 因 子 I F N-、信 号 通 路 受 体 I L-1 2 受 体 1（I L-1 2 R 1）和 信 号 转 录 与 转 录 激 活 因子 1（S T A T 1）的 表 达。结 果 经 免 疫 磁 珠 分 选 获 得 高 表 达 C D 6 2 L 的 初 始 C D 4+T 细 胞。与 T h 1 诱 导 组 和 诱导+模 拟 物 对 照
5、组 相 比，诱 导+m i R-2 1-5 p 模 拟 物 组 C D 4+I F N-+细 胞 百 分 比 显 著 降 低（P 0.0 1）；T h 1 细 胞 极化 相 关 J a n u s 激 酶（J A K）/S T A T 信 号 通 路 关 键 转 录 因 子 S T A T 1（P 0.0 1）、S T A T 4（P 0.0 5）和 T 盒 2 1 转 录因 子（T-b e t）（P 0.0 1）m R N A 表 达 显 著 下 调，I F N-（P 0.0 1）和 I L-1 2 R 1（P 0.0 5）m R N A 表 达 水 平 亦 显 著下 调，同 时 S T A
6、 T 1 和 S T A T 4 蛋 白 磷 酸 化 水 平 显 著 降 低（P 0.0 1）。结 合 双 荧 光 素 酶 报 告 系 统 结 果 表 明，m i R-2 1-5 p 模 拟 物 可 分 别 特 异 性 靶 向 结 合 I F N-（P 0.0 1），I L-1 2 R 1（P 0.0 1）和 S T A T 1（P 0.0 5）基 因 的3-非 翻 译 区，而 对 应 靶 向 位 点 突 变 后 m i R-2 1-5 p 模 拟 物 不 影 响 其 表 达。结 论 m i R-2 1-5 p 可 靶 向 下 调 I F N-，I L-1 2 R 1和 S T A T 1 表
7、 达，抑 制 I L-1 2 和 I F N-介 导 的 J A K/S T A T 信 号 通 路 活 化，从 而 抑 制 T h 1 细 胞 极 化。关 键 词：m i R-2 1-5 p；辅 助 性 T 细 胞；初 始 C D 4+T 细 胞；J a n u s 激 酶；信 号 转 导 与 转 录 激 活 因 子中 图 分 类 号：R 9 6 3，R 9 6 7 文 献 标 志 码：A 文 章 编 号：1 0 0 0-3 0 0 2-（2 0 2 3）0 9-0 6 8 0-0 8D O I：1 0.3 8 6 7/j.i s s n.1 0 0 0-3 0 0 2.2 0 2 3.0
8、9.0 0 5精 确 而 严 格 的 免 疫 调 控 是 机 体 抵 御 病 毒、细菌、真 菌 和 寄 生 虫 等 病 原 体 感 染 的 重 要 保 障。免 疫细 胞 及 其 产 生 的 多 种 细 胞 因 子 是 免 疫 调 控 的 主 要执 行 者，在 维 持 机 体 免 疫 系 统 稳 态 过 程 中 发 挥 关 键作 用。T 淋 巴 细 胞 是 免 疫 系 统 的 重 要 组 成 部 分，据其 表 面 标 志 物 主 要 分 为 C D 4+和 C D 8+T 淋 巴 细 胞，其 中 C D 4+T 淋 巴 细 胞 又 称 为 辅 助 性 T 细 胞（h e l p e rT c e
9、 l l s，T h），可 产 生 丰 富 的 细 胞 因 子。初 始（n a v e）C D 4+T 细 胞 又 称 T h 0 细 胞，是 适 应 性 免 疫反 应 的 关 键 细 胞。据 所 处 的 微 环 境，包 括 细 胞 因 子信 号、共 刺 激 信 号、炎 症 环 境 及 T 细 胞 受 体 与 抗 原 相互 作 用 的 强 度，T h 0 细 胞 可 进 一 步 分 化 为 多 种 效 应亚 群，包 括 T h 1 细 胞、T h 2 细 胞、T h 1 7 细 胞、滤 泡 T h细 胞 和 诱 导 调 节 性 T 细 胞 等 1-2。J a n u s 激 酶（J a n u
10、 s k i n a s e，J A K）/信 号 转 导 与转 录 激 活 因 子（s i g n a l t r a n s d u c e r a n d a c t i v a t o r o ft r a n s c r i p t i o n，S T A T）通 路 是 调 控 T h 0 细 胞 分 化 的关 键 信 号 通 路，多 种 T h 细 胞 亚 群 和 免 疫 反 应 类 型 均受 其 调 控，其 中 T h 1 细 胞 是 行 使 免 疫 监 视、保 障 机体 免 疫 环 境 稳 态 的 主 要 参 与 者，T h 1 细 胞 极 化 亦 受J A K/S T A
11、T 信 号 通 路 影 响。现 有 研 究 表 明，树 突 状细 胞 等 抗 原 递 呈 细 胞 摄 取 抗 原 并 分 泌 产 生 的 白 细胞 介 素 1 2（i n t e r l e u k i n-1 2，I L-1 2）可 激 活 S T A T 4 介导 的 J A K/S T A T 信 号 通 路，活 化 的 S T A T 4 促 进 T h 1细 胞 极 化 关 键 转 录 因 子 T 盒 2 1 转 录 因 子（T-b o x 2 1t r a n s c r i p t i o n f a c t o r，T-b e t）表 达，进 而 诱 导 T h 1 细胞 极
12、化 的 关 键 细 胞 因 子 干 扰 素（i n t e r f e r o n-，I F N-）产 生。与 此 同 时，由 自 然 杀 伤 细 胞 或 极 化 的 T h 1 细胞 分 泌 的 I F N-，通 过 其 受 体 介 导 J A K/S T A T 信 号 论 著 基 金 项 目：国 家 重 点 研 发 计 划（2 0 1 6 Y F C 1 0 0 0 3 0 5）作 者 简 介：李 露，硕 士 研 究 生，主 要 从 事 糖 尿 病 发 病 机 制 和防 治 策 略 研 究，E-m a i l：l i l u 1 1 2 7 t m u.e d u.c n通 讯 作 者：
13、郑 荣 秀，E-m a i l：r z h e n g t m u.e d u.c n；张 毅，E-m a i l：z h a n g y i 6 1 2 h o t m a i l.c o m 6 8 0中 国 药 理 学 与 毒 理 学 杂 志 2 0 2 3 年 9 月 第 3 7 卷 第 9 期 C h i n J P h a r m a c o l T o x i c o l，V o l 3 7，N o 9，S e p 2 0 2 3通 路 活 化，活 化 S T A T 1 并 诱 导 T-b e t 表 达，进 一 步 正反 馈 促 进 T h 1 细 胞 极 化 3-4。据 此
14、，在 T h 1 细 胞 极 化调 控 过 程 中，I L-1 2 等 T h 1 细 胞 极 化 相 关 细 胞 因 子 可激 活 J A K/S T A T 信 号 通 路，诱 发 一 系 列 级 联 反 应 促进 I F N-大 量 产 生，最 终 决 定 T h 1 细 胞 极 化 的 命 运并 促 进 炎 症 反 应 进 展。机 体 的 免 疫 系 统 稳 态 需 要 促 炎 因 子 与 抑 炎 因子 协 同 调 节，异 常 活 化 的 T h 1 细 胞 可 靶 向 自 身 抗 原肽，诱 发 机 体 免 疫 系 统 功 能 紊 乱，导 致 诸 如 类 风 湿性 关 节 炎、胰 岛
15、素 依 赖 型 糖 尿 病、系 统 性 红 斑 狼 疮、多 发 性 硬 化 症 和 桥 本 甲 状 腺 炎 等 5-6。因 此，维 持 免疫 系 统 稳 态 及 适 度 的 T h 1 细 胞 极 化 对 防 治 自 身 免疫 性 疾 病 具 有 重 要 临 床 意 义。物 种 间 高 度 保 守 的 微 R N A（m i c r o R N A，m i R N A）可 通 过 特 异 性 结 合 靶 标 m R N A 的 3-非 翻 译 区（u n t r a n s l a t e d r e g i o n s，U T R），诱 导 m R N A 降 解 并抑 制 m R N A
16、进 一 步 翻 译 为 蛋 白 质，在 翻 译 水 平 抑 制靶 基 因 表 达 7。m i R N A 是 长 度 为 1 9 2 5 个 核 苷 酸的 单 链 非 编 码 R N A，其 序 列 长 度 使 其 靶 向 调 控 具 有多 样 性，可 通 过 多 靶 标 m R N A 调 控 形 成 复 杂 的 调 控网 络，影 响 细 胞 生 长、增 殖、分 化、凋 亡 和 应 激 等 重要 生 理 进 程 8-9。本 研 究 室 基 于 前 期 对 间 充 质 干 细胞 外 泌 体 m i R N A 测 序 分 析 发 现，其 外 泌 体 内 富 含 高丰 度 的 m i R-2 1
17、-5 p。为 探 究 m i R-2 1-5 p 是 否 参 与 间充 质 干 细 胞 免 疫 调 控，本 研 究 通 过 体 外 诱 导 初 始C D 4+T 细 胞 向 T h 1 细 胞 极 化，研 究 m i R-2 1-5 p 对T h 1 细 胞 极 化 的 抑 制 作 用 及 其 分 子 机 制。1 材 料 与 方 法1.1 动 物、细 胞、主 要 试 剂 和 仪 器6 周 龄 S P F 级 雄 性 C 5 7 B L/6 N 小 鼠（北 京 维 通利 华 实 验 动 物 技 术 有 限 公 司），动 物 合 格 证 号：S C X K（京）2 0 2 1-0 0 0 6，所
18、涉 及 动 物 实 验 经 军 事 科学 院 军 事 医 学 研 究 院 实 验 动 物 伦 理 委 员 会 批 准，编号 I A C U C-D W Z X-2 0 2 1-7 0 4。人 宫 颈 癌 细 胞（H e L a细 胞），军 事 科 学 院 军 事 医 学 研 究 院 辐 射 医 学 研 究所 细 胞 库。D M E M 培 养 基、R P M I 1 6 4 0 培 养 基、-M E M 培 养 基、胰 酶、P B S 和 非 必 需 氨 基 酸，美 国G i b c o 公 司；胎 牛 血 清，德 国 P A N S e r a t e c h 公 司；小鼠 脾 淋 巴 细
19、胞 分 离 试 剂 盒，天 津 灏 洋 生 物 科 技 有 限公 司；小 鼠 初 始 C D 4+T 细 胞 分 选 试 剂 盒，德 国 M i l t e n y i B i o t e c 公 司；抗 小 鼠 C D 3，C D 2 8 和 I L-4 单 克隆 抗 体、重 组 小 鼠 I L-2 和 I L-1 2 及 P E-抗 小 鼠 C D 4和 A P C-抗 小 鼠 I F N-流 式 用 抗 体，美 国 T o n b o B i o s c i e n c e s 公 司；T r i t o n X-1 0 0、T w e e n-2 0、T r i z o l 试剂 和
20、巯 基 乙 醇，美 国 S i g m a 公 司；甲 醛 水 溶 液，国药 集 团 有 限 公 司；小 鼠 抗 小 鼠 磷 酸 化 S T A T 4（p h o s p h o r y l a t e d S T A T 4，p-S T A T 4）单 克 隆 抗 体，美 国S a n t a C r u z B i o t e c h n o l o g y 公 司；兔 抗 小 鼠 S T A T 4，S T A T 1 和 p-S T A T 1 单 克 隆 抗 体，美 国 C e l l S i g n a l i n g T e c h n o l o g y 公 司；小 鼠 抗
21、小 鼠 G A P D H 单 克 隆抗 体、H R P-山 羊 抗 小 鼠 I g G 抗 体（二 抗）、H R P-山 羊抗 兔 I g G 抗 体（二 抗）、5 S D S-P A G E 上 样 缓 冲 液、U l t r a S Y B R 混 合 物 和 B C A 蛋 白 定 量 试 剂 盒，康 为世 纪 有 限 公 司；E C L 发 光 液，百 赛 生 物 有 限 公 司；O l i g o d T、d N T P、R a n d o m、D T T、R N A 酶 抑 制 剂、5 R N A 酶 M-M L V 缓 冲 液 和 R N A 酶 M-M L V 逆 转 录酶，
22、日 本 T a K a R a 公 司；J e t P R I M E 和 J e t P R I M E 缓冲 液，法 国 P o l y p l u s 公 司；双 荧 光 素 酶 报 告 检 测 试剂 盒，美 国 P r o m e g a 公 司；D E P C 水、m i R-2 1-5 p 模拟 物（m i m i c）和 模 拟 物 对 照 核 酸 序 列（表 1）及 实 时定 量 P C R（r e a l-t i m e q u a n t i t a t i v e P C R，R T-q P C R）引物（表 2），上 海 生 工 生 物 有 限 公 司。C K X 5
23、3 S F-R 型倒 置 显 微 镜，日 本 O l y m p u s 公 司；7 5 0 0 实 时 荧 光 定量 P C R 仪 和 低 温 高 速 离 心 机，美 国 T h e r m o F i s h e r 公司；T e c a n S p a r k 多 功 能 酶 标 仪，瑞 士 帝 肯 公 司。T a b.1 S e q u e n c e s o f m i c r o R N A（m i R N A）m i R N Am i R-2 1-5 pm i m i cM i m i c c o n t r o lS e q u e n c e(5-3)S e n s e：U
24、 A G C U U A U C A G A C U G A U G U U G AA n t i s e n s e：A A C A U C A G U C U G A U A A G C U A U US e n s e：U U G U A C U A C A C A A A A G U A C U GA n t i s e n s e：G U A C U U U U G U G U A G U A C A A U UT a b.2 P r i m e r s e q u e n c e s f o r r e a l-t i m e q u a n t i t a t i v e P C
25、 R（R T-q P C R）I F N-：i n t e r f e r o n-；S T A T：s i g n a l t r a n s d u c e r a n d a c t i v a t o r o f t r a n s c r i p t i o n；I L-1 2 R 1：i n t e r l e u k i n 1 2 r e c e p t o r 1；T-b e t：T-b o x 2 1t r a n s c r i p t i o n f a c t o r；G A P D H：g l y c e r a l d e h y d e-3-p h o s p
26、h a t e d e h y d r o g e n a s e.G e n eI F N-S T A T 1S T A T 4I L-1 2 R 1T-b e tG A P D HS e q u e n c e(5-3)F o r w a r d：C A C C T G A T T A C T A C C T T C T T C A GR e v e r s e：G T T G T T G A C C T C A A A C T T G GF o r w a r d：G T A A T C T C C A G G A T A A C T T C C AR e v e r s e：T C T
27、 T C C T T T C T T C C T T C A G A CF o r w a r d：T G A A A C T G C A A T G A A T T C C CR e v e r s e：T C C A G T T T C A T C T G C T T C CF o r w a r d：T A C A A C T G G A C C A A G A C G A CR e v e r s e：A C A T T C C A G T C C A T T C G C AF o r w a r d：C A A T G T G A C C C A G A T G A T C GR e
28、 v e r s e：T C T C C A T C A T T C A C C T C C A CF o r w a r d：A C T C T T C C A C C T T C G A T G CR e v e r s e：C C G T A T T C A T T G T C A T A C C A G G 6 8 1中 国 药 理 学 与 毒 理 学 杂 志 2 0 2 3 年 9 月 第 3 7 卷 第 9 期 C h i n J P h a r m a c o l T o x i c o l，V o l 3 7，N o 9，S e p 2 0 2 31.2 小 鼠 脾 单 个 核
29、 细 胞 提 取安 乐 法 处 死 6 周 龄 C 5 7 B L/6 N 小 鼠，无 菌 条 件下 取 脾 制 备 单 细 胞 悬 液，4 5 0 g 离 心 1 0 m i n，弃 上清，用 小 鼠 淋 巴 细 胞 稀 释 液 重 悬 后 加 入 淋 巴 细 胞 分离 液，4 5 0 g 离 心 3 0 m i n，收 集 中 间 层 细 胞 获 得 脾单 个 核 细 胞。1.3 小 鼠 初 始 C D 4+T 细 胞 免 疫 磁 珠 分 选按 小 鼠 初 始 C D 4+T 细 胞 分 选 试 剂 盒 操 作。在分 离 的 小 鼠 脾 单 个 核 细 胞 中 加 入 生 物 素 标 记
30、的M i l t e n y i 鸡 尾 酒 抗 体，于 4 孵 育 5 m i n，加 入 抗 生物 素 单 克 隆 抗 体 耦 联 磁 珠 和 抗 C D 4 4 单 克 隆 抗 体 耦联 磁 珠 继 续 孵 育 1 0 m i n，转 移 至 离 心 管 中 用 磁 珠 分离 缓 冲 液 洗 涤 1 次。将 细 胞 通 过 磁 场，经 磁 性 分 离柱 吸 附 后 洗 脱 获 得 初 始 C D 4+T 细 胞。1.4 诱 导 初 始 C D 4+T 细 胞 向 T h 1 细 胞 极 化 及m i R-2 1-5 p 模 拟 物 转 染2 4 孔 板 预 先 以 抗 小 鼠 C D 3
31、 单 抗（2 m g L-1）4 包 被 过 夜，将 新 鲜 分 离 的 初 始 C D 4+T 细 胞（每孔 5 1 05细 胞）接 种 入 2 4 孔 板，加 入 T h 1 极 化 诱 导剂（抗 小 鼠 C D 2 8 单 抗 0.5 m g L-1、抗 小 鼠 I L-4 单 抗1 m g L-1、重 组 小 鼠 I L-2 5 g L-1、重 组 小 鼠 I L-1 21 0 g L-1、1%非 必 需 氨 基 酸 和 巯 基 乙 醇 5 5 m o l L-1），用 含 1 0%胎 牛 血 清 的 R P M I 1 6 4 0 培 养 基 于 3 7，5%C O2条 件 下 培
32、养。m i R-2 1-5 p 模 拟 物 或 模 拟 物 对 照 2.5 n m o l 分 别溶 解 于 D E P C 水 1 2 5 L，配 制 终 浓 度 为 2 0 m o l L-1溶 液。分 别 取 3.3 3 L 溶 解 于 1 0 0 L J e t P R I M E 缓冲 液 中，加 入 J e t P R I M E 2.6 L 于 室 温 静 置 1 5 m i n，待 组 装 成 脂 质 体 复 合 物 后 转 染 至 加 入 T h 1 极 化 诱导 剂 的 初 始 C D 4+T 细 胞。诱 导 7 2 h 后 分 别 收 取T h 1 诱 导 组、诱 导+模
33、 拟 物 对 照 组 和 诱 导+m i R-2 1-5 p模 拟 物 组 细 胞，进 行 后 续 实 验。1.5 流 式 细 胞 术 检 测 T h 1 细 胞 极 化 百 分 比取 1.4 收 取 的 细 胞，加 入 P E-抗 小 鼠 C D 4 流 式抗 体，4 避 光 孵 育 3 0 m i n；P B S 洗 涤 后 加 入 4%中性 甲 醛 固 定 1 0 m i n，用 5 0 0 L 含 0.1%T r i t o n X-1 0 0的 P B S 破 膜 7 m i n；用 5 0 0 L 含 0.1%T w e e n-2 0 的P B S 洗 涤 后，加 入 A P C
34、-抗 小 鼠 I F N-流 式 抗 体 4 避 光 孵 育 3 0 m i n。洗 涤 后 用 P B S 重 悬，于 流 式 细 胞仪 检 测 C D 4+I F N-+细 胞 百 分 比，即 T h 1 细 胞 极 化 百分 比。1.6 R T-q P C R 检 测 I F N-，S T A T 1，S T A T 4，I L-1 2 R 1和 T-b e t m R N A 表 达 水 平取 1.4 收 取 的 细 胞，T r i z o l 法 提 取 总 R N A，取 1 g逆 转 录 为 c D N A，R T-q P C R 检 测 I F N-，S T A T 1，S T
35、 A T 4，I L-1 2 R 1和 T-b e t m R N A 水 平。反 应 体 系：c D N A 1 L，P C R 上 下 游 引 物（1 0 m o l L-1）各0.5 L，U l t r a S Y B R 混 合 物 1 0 L 和 D E P C 水 8 L；反 应 条 件：9 5 1 0 m i n；9 5 1 5 s，6 0 1 m i n，4 0 个 循 环；9 5 1 5 s，6 0 1 m i n，9 5 1 5 s。G A P D H 作 为 内 参 基 因，待 测 基 因 m R N A 表 达 水 平用 2-C t表 示。1.7 W e s t e r
36、 n 印 迹 法 检 测 S T A T 4，p-S T A T 4，S T A T 1和 p-S T A T 1 蛋 白 表 达 水 平取 1.4 收 取 的 细 胞，加 8 0 L 细 胞 裂 解 液 于 摇 床冰 浴 震 荡 裂 解 细 胞 3 0 m i n，1 2 0 0 0 g 离 心 2 5 m i n收 集 上 清。经 B C A 蛋 白 定 量 后，加 入 含 有 巯 基 乙醇 的 5 S D S-P A G E 上 样 缓 冲 液 煮 沸。取 2 0 g 蛋白 样 品 电 泳，经 1 0%S D S P A G E 凝 胶 电 泳，转 移 至P V D F 膜；5%脱 脂
37、奶 粉 室 温 封 闭 1 h，分 别 与 抗S T A T 4，p-S T A T 4，S T A T 1，p-S T A T 1 和 G A P D H 抗体（稀 释 比 1 5 0 0）4 孵 育 过 夜；T B S T 洗 膜 3 次，加入 H R P-山 羊 抗 小 鼠 I g G 或 H R P-山 羊 抗 兔 I g G 抗 体（稀 释 比 1 3 0 0 0 0），室 温 孵 育 1 h；T B S T 洗 膜 3 次，E C L 化 学 发 光 显 影，测 定 蛋 白 条 带 积 分 吸 光 度 值。待 测 蛋 白 表 达 水 平 用 待 测 蛋 白 条 带 与 G A P
38、D H 条 带积 分 吸 光 度 比 值 表 示。1.8 双 荧 光 素 酶 报 告 载 体 构 建 及 m i R-2 1-5 p 模 拟物 对 S T A T 1，I F N-和 I L-1 2 R 1表 达 调 控 作 用 验 证经 生 物 信 息 学 分 析 预 测 I L-1 2 R 1，I F N-和S T A T 1 的 3-U T R 可 能 存 在 m i R-2 1-5 p 的 作 用 靶 标序 列，利 用 p s i C H E C K 2 分 别 构 建 各 靶 标 序 列 的 双荧 光 素 酶 报 告 载 体，即 将 正 常 3-U T R 序 列（w i l dt
39、y p e，W T）和 靶 序 列 结 合 位 点 突 变（m u t a n t，M T）的3-U T R 序 列 分 别 插 入 到 p s i C H E C K 2 载 体 携 带 的人 源 化 海 肾 荧 光 素 酶（h u m a n c o d o n o p t i m i z e d-R e n i l l a l u c i f e r a s e，h R l u c）的 3-U T R 区 域，构 建h R l u c 的 报 告 基 因 表 达 载 体 p s i-W T 和 p s i-M T。p s i C H E C K 2 含 有 h l u c+作 为 内 参
40、 报 告 基 因。转 染 前 1 d 将 H e L a 细 胞（每 孔 2 1 04细 胞）接种 于 9 6 孔 板，待 细 胞 密 度 汇 合 至 6 0%8 0%时，将p s i-W T 和 p s i-M T 载 体 分 别 与 m i R-2 1-5 p 模 拟 物 或模 拟 物 对 照 共 转 染 至 H e L a 细 胞 中。取 2 0 n g 载 体和 0.2 L m i R-2 1-5 p 模 拟 物 或 模 拟 物 对 照 溶 解 于1 5 L J e t P R I M E 缓 冲 液 中，加 入 J e t P R I M E 0.5 L混 匀 后 于 室 温 静 置
41、 1 5 m i n，待 形 成 脂 质 体 复 合 物 后加 入 H e L a 细 胞 培 养 体 系。用 含 1 0%胎 牛 血 清 的D M E M 培 养 基 在 3 7，5%C O2条 件 下 培 养 3 6 h，收 取 并 裂 解 细 胞 进 行 双 荧 光 素 酶 报 告 基 因 检 测。取 细 胞 裂 解 上 清 2 0 L，加 入 L u c i f e r a s e A s s a y 底 物 6 8 2中 国 药 理 学 与 毒 理 学 杂 志 2 0 2 3 年 9 月 第 3 7 卷 第 9 期 C h i n J P h a r m a c o l T o x
42、i c o l，V o l 3 7，N o 9，S e p 2 0 2 32 0 L，经 T e c a n 酶 标 仪 检 测 内 参 h l u c+产 生 的 荧 光信 号 强 度；再 加 入 S t o p&G l o 底 物 2 0 L，用 T e c a n酶 标 仪 检 测 靶 标 序 列 的 h R l u c 产 生 的 荧 光 信 号 强 度。h R l u c 与 h l u c+荧 光 信 号 强 度 比 值 表 示 荧 光 素 酶 活性，反 映 m i R-2 1-5 p 模 拟 物 或 模 拟 物 对 照 对 靶 序 列的 调 控 作 用。1.9 统 计 学 分 析
43、实 验 结 果 数 据 以 x s 表 示，经 S P S S S t a t i s t i c s2 6 软 件 进 行 数 据 分 析，组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分析，两 组 间 比 较 采 用 t 检 验。P 0.0 5 为 差 异 具 有 统计 学 意 义。2 结 果2.1 m i R-2 1-5 p 抑 制 T h 1 细 胞 极 化对 小 鼠 脾 单 个 核 细 胞 进 行 免 疫 磁 珠 阴 性 分 选（图 1 A），获 得 的 细 胞 经 流 式 细 胞 术 检 测 为 高 表 达C D 6 2 L 的 C D 4+T 细 胞（图 1 B），符 合 初 始
44、C D 4+T细 胞 特 征。向 初 始 C D 4+T 细 胞 中 加 入 T h 1 极 化 诱导 剂，同 时 转 染 m i R-2 1-5 p 模 拟 物 或 模 拟 物 对 照，7 2 h 后 流 式 细 胞 术 检 测 C D 4+I F N-+双 阳 细 胞 百 分比。结 果（图 1 C）表 明，T h 1 诱 导 组 细 胞 极 化 百 分 比为（7 6.3 0.6）%；诱 导+模 拟 物 对 照 组 为（7 6.9 2.1）%，与 T h 1 诱 导 组 比 较 无 明 显 变 化；诱 导+m i R-2 1-5 p 模 拟 物 组 为（6 8.1 2.2）%，与 T h 1
45、 诱 导 组 和诱 导+模 拟 物 对 照 组 比 较 均 明 显 降 低（P 0.0 1）。以上 结 果 表 明，在 诱 导 初 始 C D 4+T 细 胞 向 T h 1 细 胞极 化 体 系 内 转 染 m i R-2 1-5 p 模 拟 物 可 显 著 抑 制 T h 1细 胞 极 化。2.2 m i R-2 1-5 p 抑 制 J A K/S T A T 信 号 通 路 活 化图 2 A 结 果 显 示，转 染 m i R-2 1-5 p 模 拟 物 后，T h 1 细 胞 极 化 所 需 的 关 键 转 录 因 子 T-b e t 和 关 键 细胞 因 子 I F N-m R N
46、A 表 达 水 平 较 转 染 模 拟 物 对 照显 著 下 降（P 0.0 1）；同 时，参 与 调 控 T h 1 细 胞 极 化的 I L-1 2/S T A T 4/I F N-途 径 和 I F N-/S T A T 1 途 径的 关 键 转 录 因 子 S T A T 1（P 0.0 1）和 S T A T 4（P 0.0 5）及 受 体 I L-1 2 R 1（P 0.0 5）m R N A 表 达 水 平亦 显 著 降 低。诱 导+模 拟 物 对 照 组 上 述 细 胞 因 子m R N A 水 平 与 T h 1 诱 导 组 比 较 均 无 明 显 变 化。图 2 B 结 果
47、 显 示，转 染 m i R-2 1-5 p 模 拟 物 后，p-S T A T 1 和 p-S T A T 4 蛋 白 表 达 水 平 显 著 低 于 诱导+模 拟 物 对 照 组（P 0.0 1），S T A T 1 和 S T A T 4 蛋 白表 达 水 平 无 明 显 变 化，表 明 m i R-2 1-5 p 模 拟 物 可 抑制 S T A T 1 和 S T A T 4 蛋 白 磷 酸 化 活 化。2.3 m i R-2 1-5 p 调 控 T h 1 细 胞 极 化 通 路 的 作 用 靶 标经 生 物 信 息 学 分 析 与 预 测，m i R-2 1-5 p 可 能 与T
48、 h 1 细 胞 极 化 所 必 需 的 J A K/S T A T 信 号 通 路 的 重 要分 子 I F N-，I L-1 2 R 1和 S T A T 1 的 3-U T R 存 在 特F i g.1 m i R-2 1-5 p m i m i c b l o c k e d T h 1 c e l l p o l a r i z a t i o n.A：s t r a t e g y o f m u r i n e n a v e C D 4+T c e l l s i s o l a t i o n；B：c h a r a c t e r i z a t i o no f t h
49、e p u r i f i e d n a v e C D 4+T c e l l s e x a m i n e d b y f l o w c y t o m e t r y；C：t h e p e r c e n t a g e o f C D 4+I F N-+c e l l s i n T h 1 c e l l s i n d u c e d f r o m t h en a v e C D 4+T c e l l s a n d t r a n s f e c t e d m i R-2 1-5 p m i m i c o r m i m i c c o n t r o l f
50、o r 7 2 h m e a s u r e d b y f l o w c y t o m e t r y；C 2：s t a t i s t i c r e s u l t s o f C 1.x s，n=3.*P 0.0 1，c o m p a r e d w i t h T h 1 i n d u c t i o n g r o u p；#P 0.0 1，c o m p a r e d w i t h i n d u c t i o n+m i m i c c o n t r o l g r o u p.6 8 3中 国 药 理 学 与 毒 理 学 杂 志 2 0 2 3 年 9 月
