1、抗生素微生物测定法,威海市药品检验所 董丽萍,概述,（1）抗生素定义 抗生素是生物在其生命活动过程中产生的（或用化学、生物或生化方法所衍生的），在低微浓度下能选择性地抑制他种生物机能的化学物质。,（2）抗生素分类根据其化学结构分为8类：-内酰胺类抗生素：包括青霉素类、头孢菌素类、头霉菌素类、克拉维酸等。氨基糖苷类抗生素：包括链霉素、卡那霉素、庆大霉素和新霉素等。大环内酯类抗生素：包括红霉素、麦迪霉素、柱晶白霉素等。四环类抗生素：包括四环素、土霉素、金霉素等。,多烯类抗生素：包括曲古霉素、制霉菌素、两性霉素B等。多肽类抗生素：包括多粘菌素、放线菌素、博来霉素等。环桥类抗生素：包括利福霉素及其衍生
2、物。蒽环类抗生素：包括柔毛霉素（正定霉素）、色霉素、阿霉素、橄榄霉素等。,检定方法的分类,随着科技的的发展、分离分析技术的提高，抗生素的分子结构及成分更加清楚，所以很多抗生素品种都改为高效液相法或其他仪器测定法，既准确又快速。但对一些组分复杂的复合抗生素品种，目前仍应用此法。 优点：（1）微生物检定法可直观、特异地反应出抗生素药品的抗菌活性，显示临床的特点；（2）多组分抗生素由于不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、含量和活性的关系；（3）许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当的化学分析方法表征其活性；（4）同时微生物法所需仪器设备简单，成本低。一般分为稀释法、比浊法和
3、琼脂扩散法。目前，比浊法和琼脂扩散法被列为抗生素微生物检定方法，收载于药典中。,（一）稀释法：使用液体培养基将抗生素稀释为多种浓度，再各加入等量的试验菌菌液，在37、一定时间培养，以何种稀释度抑制细菌生长作为测定终点再以同样处理的标准抗生素重点作比较，即可求得抗生素的效价，但由于此法终点的判别较难，所得结果是一种范围而不是绝对值，因此该法已不用于效价测定，而用于研究新药与临床药敏试验、研究等。（二）比浊法：在原理及操作上大致与稀释法相似。只是重点根据试验细菌生长情况即浑浊程度采用分光光度法测定吸光度来求出供试品的效价。该方法快速、准确，不受扩散因素的影响，自动化程度高，检测过程直观。,中国药典
4、从2005年版开始收载浊度法，当时只收载硫酸庆大霉素一个品种。2010年版新增21个品种增加到22个品种。（三）琼脂扩散法：用不同的试验设计方法将供试品和标准品接触与固体培养基表面，经培养后，抗生素向培养基中扩散，抑制细菌繁殖而形成透明的抑菌圈。其中的管碟法是最常用的方法，可分为：一剂量法、二剂量法及三剂量法。主要又以二剂量法为主。,管碟法原理：是利用抗生素在含敏感试验菌的琼脂培养基中的球面扩散渗透作用，从而形成一定的抑菌圈。通过琼脂培养基，可观察并测量出抑菌圈的大小。在一定的抗生素浓度范围内，对数剂量(浓度)与抑菌圈的表面积或直径成正比,抑菌圈的形成,将不锈钢小管(俗称为牛津杯)放置在含敏感
5、试验菌的琼脂培养基上，将抗生素溶液注入小钢管中，抗生素分子随溶剂向培养基内呈球面状放射状扩散。同时将培养基置入适宜试验菌生长的培养箱中，琼脂培养基中的试验菌开始生长。抗生素分子在琼脂培养基中的浓度，随离开小钢管的距离增大而降低，离小钢管愈远，琼脂培养基中抗生素分子愈少，相应的抗生素浓度愈低。当抗生 素分子扩散到一定时间，在 小钢管周围形成一个能有效 的抑制试验菌生长的范围， 也就是通常所说的抑菌圈。 抗生素溶液的浓度不同，抑 菌圈的大小亦不同(图)。,抗生素的效价和单位,一、抗生素的效价和单位 抗生素的含量用效价和单位表示。该词有时不加区别统称为效价单位。 效价（potency）：指检品的实际
6、单位数与其标示量的比值。常表示为效价的百分数。效价是从比较检品与标准品的生物活性而得。在不同的微生物效价测定中，效价计算的公式见后述。 单位（unit,u）单位是衡量抗生素有效成分的具体尺度。各种抗生素的单位含义不同，在习惯上根据它们的实际发展情况而定，抗生素效价单位的具体表示方法见后述。 标准品与国际单位(international unit,iu) 抗生素微生物测定用的标准品，除国内的新品种外，凡已制备国际标准品的品种，在制备国家标准品时，均与国际标准品比较而定出效价。,抗生素的效价单位的表示方法,、质量单位 以抗生素的生物活性部分质量作单位，微克（）单位，毫克单位。,、类似质量单位 以特
7、定的纯粹抗生素盐类的质量作为单位。如纯粹金霉素盐酸盐及四环素盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内）微克（）单位，毫克个单位。这是根据国际使用习惯而来的。,、质量折算单位 以特定的纯抗生素盐的质量为单位而加以折算。,、特定单位 以特定的抗生素样品的某一质量定为一单位。,标准品的称量 标准品的稀释标准品溶液,供试品的称量 供试品的稀释供试品溶液,缓冲液的制备,培养基的制备,底层20 ml菌层5ml ,平板的制备,凝固后 凝固后, ,菌液的制备,加菌液,加小钢管,-,可靠性测验，计算结果 测量抑菌圈培 养,抗生素效价检定管碟法操作流程,加陶瓦盖,抑菌圈测量仪,二、操作方法基本要点 ： 高剂量抗生素溶液
8、所形成的抑菌圈直径在2024 mm，个别抗生素的抑菌圈可在1824 mm； 高、低剂量所形成的抑菌圈之差最好大于2 mm，有些抗生素的差数可较小； 高、低剂量之比一般用2:1，当高、低剂量所致的抑菌圈差别较小时，可用高低剂量之比为4:1的比率。,仪器与用具 1. 操作室 2. 双碟 3. 陶瓦盖 4. 钢管 5. 钢管放置器（图46） 6. 恒温培养箱 7. 灭菌刻度吸管 8. 玻璃容器 9. 称量瓶,图：钢管放置器（北京先驱威锋技术开发公司生产开发）,10.可调式移液器（11000l) 11.天平 分析天平，感量0.1mg。12.抑菌圈(直径)测量仪。13.超净工作台用于菌种的接种或传代。超
9、净工作台须置洁净工作室或半无菌室内。,试液1. 灭菌缓冲液试剂应为分析纯，配制后应澄明，分装于玻璃容器内，经115蒸汽灭菌30min备用。2. 磷酸盐缓冲液（pH6.0）3. 磷酸盐缓冲液（pH7.0）4. 磷酸盐缓冲液 （pH7.8） 5. 磷酸盐缓冲液 （pH10.5 ),(三) 培养基培养基中原料的质量对抑菌圈边缘清晰度及试验结果的精确度影响较大，因此应对原材料进行预试验，挑选适当的牌号使用。制成的培养基不应有沉淀，如产生沉淀，可在配制培养基后，置115，20 min溶化，趁热用纸浆减压或适宜方法过滤，调整pH值，分装灭菌备用。,试验用菌种检定用标准菌种，由中检所提供为冷冻干燥菌种。,1
10、. 菌种的复苏 砂轮刻痕，外壁碘酒消毒、75%酒精棉擦净，火焰烧灼，灭菌滴管吸肉汤滴在灼热管痕处使聚冷而炸裂。管口打开，另取灭菌滴管吸肉汤少许，将冻干菌块溶解，吸出菌液接种至普通肉汤内，或琼脂斜面置3537培养2224 h,观察菌苔形态、涂片，革兰染色镜检，呈典型菌形即可应用。,2. 菌种的接种与保存 按无菌接种要求将细菌划在斜面的表面上，将已接种的细菌管置3537培养2224 h，真菌管一般置2425真菌培养箱内培养7 d。取出后放入冰箱保存，一般34周转种一次.,3. 菌悬液的制备 依不同的菌来制备,操作步骤,管碟法抗生素效价测量实验包括配制试验所需的样品及对照品的称量稀释、加注培养基、放
11、置小钢管、滴加抗生素溶液、双碟中菌株的培养、抑菌圈测量六个步骤。 1. 称量 称量前，将标准品从冰箱取出，使与温室平衡；供试品应放于干燥器内至少30min方可称取。供试品与标准品应用同一天平；吸湿性较强的抗生素，在称量前12更换天平内干燥剂。标准品与供试品的称量最好一次取样称取，不得将已取出的标准品或供试品倒回原容器内，标准品称量不可少于20mg，取样后立即将称量瓶及被称物盖好，以免吸水。样品的称样量最好不少于50mg。,2. 稀释 稀释操作应遵照容量分析的操作规程。从冰箱中取出的标准溶液，必须先在室温放置，使其温度达到室温后，方可量取。标准品与供试品溶液的稀释应采用容量瓶，每步稀释，取样量不
12、得少于2ml为宜，稀释步骤一般不超过3步。举例：取浓溶液1000u/ml。第一步取5ml（1000U/ml）50ml容量瓶100U/ml；第二步取5ml（100u/ml）50ml容量瓶10U/ml（H）；取5ml（100U/ml）100ml容量瓶5U/ml（L）。每次吸取溶液用刻度吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管23次，吸取样品溶液后，用滤纸将外壁多余液体擦去，从起始刻度开始放溶液。稀释标准品与供试品用的缓冲液应同一批和同瓶，以免因pH或浓度不同影响测定结果。稀释时，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液体完全流下，再准确补加至刻度。,3 双碟的制备 在半无菌室内进行，应注意微生物
13、及抗生素的污染，培养基应在水浴中或微波炉中融化，避免直火加热。底层：用灭菌大口吸管（20ml）或其他灭菌分装器，吸取已融化的培养基20ml注入双碟内，等凝固后更换干燥的陶瓦盖，放于3537培养箱中保温，使易于摊布菌层。菌层:取出试验用菌悬液，按已试验妥的菌量按(2.2)法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在1824mm；用灭菌吸管吸取菌悬液加入已融化并保温在水中(一般细菌4850，芽孢可至60)的培养基内，摇匀作为菌层用。用灭菌大口10ml吸管或其他分装器，吸取菌层培养基5ml，使均匀摊布在底层培养基上，置水平台上并用陶瓦圆盖覆盖，放置20 30min，待凝固，备用。,4放置钢管 用钢管放置器
14、，将干热灭菌的镊子或适宜方法将钢管装于玻璃管中，放于钢管放置器上，将双碟打开，放入双碟台上，托起双碟台，使钢管平稳落在培养基上，注意使各个钢管下落的高度基本一致，钢管放妥后，双碟静置510 min,使钢管在琼脂内稍下稳定后，再开始加抗生素溶液。5滴加抗生素溶液每批供试品取610个双碟，滴加溶液可调式移液器，在滴加之前须用滴加液洗23次。滴加溶液的顺序:SHTHSLTL。滴加溶液至钢管口平满，注意滴加溶液间隔不可过长，因溶液的扩散时间不同影响测定结果。,每份滴加双碟数每次不超过5个，如1份溶液滴加双碟数目多，可分次滴加。滴加完毕，用陶瓦盖覆盖双碟，平稳置于双碟托盘内，双碟叠放不可超过3个，避免受
15、热不均，影响抑菌圈大小，以水平位置平稳移入培养箱中间位置，3537或3032(依试验菌的要求选用)，培养至所需时间。6抑菌圈测量将培养妥的双碟取出，打开陶瓦盖，将钢管倒入盛有1：1000苯扎溴铵溶液或其他消毒液内，换以玻璃盖，按样品号排妥；测量抑菌圈前应检查抑菌圈是否圆整，如有破圈或圈不圆整应将该碟弃之，切忌主观挑选抑菌圈及双碟，使结果造成偏倚。测量可用ZY-300型抑菌圈面积自动测量分析系统（等测定仪进行，也可用游标卡尺；使用游标卡尺测量时，眼睛视线应与读数刻度垂直，用游标卡尺的尖端与抑菌圈直径的切点成垂直方向测量。,记录与计算1. 试验记录 应包括抗生素的品种、剂型、标示量、生产厂、批号、
16、检查目的、检验依据、检验日期、温度、湿度，标准品与供试品的称量、稀释步骤与核对人，抑菌圈测量结果。当用游标卡尺测量抑菌圈直径时，应将测试数据以框图方式顺双碟数记录。当用测量仪测量面积或直径时，应将电脑测试、计算、统计分析的打印纸贴附于记录中。2. 计算注意事项：a、浓度比不等于1.000时，如标准品溶液（S）d的浓度为1005u/ml,而供试品溶液(T)的浓度995u/ml，D=S/T=1.0101；也可将D值设为1.000，而估计效价设为101.01%b、所测定的实际效价应在D值与估计效价乘积的90%和110%范围内，超出就应重新估计效价。如估计效价为100%，D=1.000，而测得的效价为
17、115%，按110%重估效价再进行试验。C、原料及不合格供试品，进行平行试验，配置两份标准品和两份供试品，一份标准品与一份供试品为一组滴样,结果判断1.可靠性测验结果认为可靠，方可进行效价和可信限率计算。2.可信限率考核实验的精密度，除药典各论另有规定外，本法的可信限率不得超过5%。上述各项规定都能符合者，试验结果成立。3. 实验计算所得效价低于估计效价的90%或高于估计效价的110%，则检验结果仅作为初试，应调整供试品估计效价，予以重试。4. 效价测定一般需双份样品，平行实验以便核对。对不符合规定的样品应至少有2次符合规定的结果，才能发出报告。,克服常见的一些影响因素,1. 实验器材的准备
18、1.1 实验器材的选择试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象,1.2 实验器材的清洗 抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素（庆大霉素、争光霉素、链霉素等）或者被清洗用的杀菌剂（如新洁而灭、
19、洗洁精等）污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。160干热灭菌2h后备用。 2. 配制试验所需的样品、标准品、缓冲液与培养基 2.1 样品与标准品溶液的配制 标准品与样品从冰箱取后，使与室温平衡。称量最好为一次取样称量，动作迅速，不得反复称取，取样后立即将称量瓶瓶盖盖好，以免吸水。标准品的称量最好用1/100,000克的分析天平，样品称量不得低于1/10,000克的分析天平。天平中的干燥剂应保持经常注意更换。称量结束后，加入磷酸缓冲液，定容至刻度，过滤并,稀释。稀释时，都应采用容量瓶，每一步稀释取样量不得少于2mL。用刻度吸管吸取溶液前，要用待稀
20、释液冲洗吸管23次，吸取溶液后，要用滤纸把刻度吸管外壁多余液体擦去，再从起始刻度开始放溶液。在称量抗生素样品过程中，操作者的工作服上有可能会沾染抗生素粉末，在配培养基、加底层培养基、加菌层培养基或滴加抗生素溶液时，会随衣袖的抖动落入培养基，造成破圈或者无抑菌圈。所以配制抗生素溶液应单独使用一套工作服。 2.2 培养基与缓冲液的配制 配制培养基与缓冲液时要按照配比用量，配制后调节其pH值。因为在pH值、盐浓度的影响下，即使琼脂培养基上的两个相邻的小管距离足够，还是可能会出现卵圆形抑菌圈。例如四环素易受pH值影响，链霉素易受盐浓度影响。培养基可以购买厂家生产的产品，因为大批量产品中的成分配比较稳定
21、，可比性较强。116湿热灭菌20min后备用。,3. 加注培养基 3.1 加注底层培养基无菌室工作台面可能因为使用时间已久，变得凹凸不平或者倾斜，会影响培养基菌层的厚度均匀性。菌层越薄，形成的抑菌圈越大，会给试验造成很大的误差。我们可以在桌面上放置一块足够大的玻璃平板，保证双碟放置区域的平整。在双碟底部预先标记样品的高低浓度区域，在加注培养基底层的时候，有顺序地按照一致方向排列。接下来加注培养基菌层的时候，仍然按照原来的位置与方向排列。这样，即使桌面不够水平，还是能够保证培养基菌层是在水平的培养基底层上铺开，达到消除误差的目的。试验中加注的培养基如果温度太低，就容易在内部结块，或者加注到双碟之
22、后不能及时铺开，使得培养基表面为非水平面，会给试验带来误差。加注6065的培养基底层之后，不应立即给双碟加盖。因为温度过高的培养基会形成大量的水蒸气，在双碟盖上凝集并滴落在已经凝固定的培养基底层上，会给培养基菌层的加注带来影响。,3.2 加注培养基菌层制备琼脂培养基菌层时，培养基温度过高或者受热时间太长都会导致试验菌死亡。当菌种为非芽孢杆菌的时候，现象尤为明显，甚至会出现无菌生长。因此，培养基应放在50水浴中保温。当加入试验菌种混匀后，应尽快加注到底层培养基上。在试验的时候，如果从大瓶内用刻度吸管吸取带菌培养基，吸管中培养基量少极易冷却，加在底层培养基上就不易均匀铺开，导致菌层厚度不均，影响到
23、抑菌圈的直径。因此可以事先把配制好的培养基分装在具塞试管内，每管5mL，湿热灭菌后放在50水浴锅内保温。试验中，再分别加入菌液混匀，配制成带菌琼脂。震荡混匀后继续保温5min使培养基温度回升，然后直接倒在底层培养基上，转动双碟使培养基均匀铺开。,4. 放置小钢管时，注意管与管之间不能太靠近，否则会引起相邻的两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中的浓度增大，相互影响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。管与双碟边缘同样也不能太靠近，因为液面浸润作用，边缘的琼脂培养基菌层为非平面，会影响抑菌圈的形状。可在试验前在双碟的底上用尺测量，作好标记，试验中可以按照双碟底面标记放置小钢管，避免放置位置不恰当产生的。小钢管放置时
24、，要小心地从同一高度垂直放在菌层培养基上，不得下陷，不得倾斜，不能用悬空往下掉的。放置之后，不能随意移动，要静置5min，使之在琼脂内稍下沉降稳定后，再开始滴加抗生素溶液。5. 滴加抗生素溶液滴加抗生素要按照SHTHSLTL,的顺序滴加。滴加之前，滴管至少要用被滴液体冲洗3次。在滴加抗生素到小钢管的时候，由于毛细管内抗生素溶液往往会有气泡或者毛细管开口端有液体残留，继续滴加容易造成气泡膨胀破裂，使溶液溅落在琼脂培养基表面造成破圈。因此一旦毛细管中出现气泡或者残留，就重新吸取抗生素溶液进行滴加，毛细管口应避免太细，滴加的时候离开小钢管口距离不要太高。滴加中若有溅出，可用滤纸片轻轻吸去，不致造成破
25、圈。在滴加中还有可能出现抗生素溶液滴入小钢管后，没有与琼脂培养基菌层接触，有一段空气被压在溶液与培养基之间，这样是不会产生抑菌圈的。此时可以小心的用滴管吸出小钢管内的抗生素溶液，弃去。换滴管重新滴加。抗生素溶液滴加后，液面应该与小钢管管口齐平，液面反光呈黑色。（抗生素液体加入量不能按滴，即使同一滴管，每滴的量也有差异。）如果抗生素溶液滴加过满，可以用无菌滤纸片小心吸去多余部分。,6. 双碟中菌株的培养滴加了抗生素溶液后的双碟忌震动，要轻拿轻放。双碟在37下培养约16h。在培养过程中，如果温度不均匀，会造成同一双碟上细菌生长速率不等，使抑菌圈变小或者不圆。所以把双碟放入培养箱时，要与箱壁保持一定
26、的距离，双碟叠放也不能超过3个。培养中，箱门不得随意开启，以免影响温度。应经常注意温度，防止意外过冷过热。7. 抑菌圈测量 7.1 试验结果中抑菌圈直径不应该过大或者过小，在试验之前，可以先做一个关于用不同浓度菌液配制的琼脂培养基菌层预试验，选择抑菌圈直径在1822mm的菌液浓度为,试验用浓度（菌液浓度约为106个/mL）。批量试验中后期，菌液保存的时间过久，菌株就会逐渐衰亡，生长周期不一致，其对抗生素的敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯，也会造成这样的结果。因此，菌液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。7.2 用游标卡尺测量抑菌圈直径，可
27、以在双碟底部垫一张黑纸，在灯光下测量。不宜取去小钢管再测量，因为小钢管中残余的抗生素溶液会流出扩散，使抑菌圈变得模糊。不能把双碟翻转过来测量抑菌圈直径，因为底面玻璃折射会影响抑菌圈测量的准确度。记录测量结果后进行效价计算。 8.讨论 试验中，往往会出现异常情况，使得试验结果与预期出现很大差异。因此抗生素试验的每一步都需要仔细谨慎，严格按照操作规范，才可以得到准确的检测结果。准确测定抗生素效价，对评价抗生素的效果，指导临床都有着重要意义。,标准品的称量,标准品,返回,试验用菌液、缓冲液、培养基、 标准品与供试品溶液的制备,制备过程,返回,双碟的制备,制备底层,制备菌层,放置小钢管,返回,滴加药液
28、到小钢管内,在恒温培养箱中培养至规定时间 （盖上陶瓷盖）,返回,测量抑菌圈,测量过程（活动）,方法一,测量仪器,图3,评价性抽验的实例分析,对常规检验数据进行合理的统计分析，不仅有助于发现药品的质量问题，同时也是评价该药品质量的重要指标。图3汇总了中检院在20092010年评价性抽验中对部分品种的数据分析结果。图3a为HPLC法测定阿奇霉素片剂得到的含量分布情况。虽然全部数据呈明显正态分布，且含量均分布在90110范围，但其含量均值不是100而是96；进一步分析发现，药品标准采用微生物检定法测定阿奇霉素片的含量，而微生物效价值较HPLC结果约高为5，说明企业没有低限投料；同时也说明微生物检定法
29、的专属性较HPLC法差，将阿奇霉素片的含量测定方法修订为,43,评价性抽验的实例分析,HPLC法更能保证产品的质量。图3b为加替沙星注射液的总杂质含量分布情况。数据总体呈正态分布，但少数数据超出正态分布范围；进一步分析，这些杂质含量相对较大的样品均来自相同的企业，通过杂质谱的分析证明注射用加替沙星的杂质主要源于原料，提示该企业采用原料的质量相对较差。图3c为注射用头孢噻肟钠的水分含量分布情况。注射用头孢噻肟钠的水分主要源于原料，数据总体呈不完整的正态分布，提示不同企业的原料生产工艺不同（相同生产工艺的样品的水分含量应呈完整的正态分别）。药品标准中注射用头孢噻肟钠的水分限度为不得过6.0%，但全
30、部样品的水分均小于5，提示水分限度没有起到工艺控制的作用。图3d为对阿奇霉素片剂片重差异（RSD）的统计分析结果。片重差异的大小可以在一定程度上反映生产工艺的成熟性。约14的产品的片重差异小于1，仅有约8的产品的片重差异在24范围，说明国产片剂的制剂工艺总体相对成熟。,45,质量来源于设计(Quality By Design QbD),何为质量来源于设计? 是一种以可靠的科学和质量风险管理为基础的系统开发方法，其始于预先设定的目标，并强调对产品和工艺的认知以及工艺控制。一种系统的方法始于预先设定的目标基于科学的和质量风险的管理强调对产品、工艺的认知以及过程控制（过程分析技术）,46,同仁堂古训,炮制虽繁必不敢省人工品味虽贵必不敢减物力,
