1、葛根素抑制凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖PreventionandT 帕 am1entofCardio-Cerebral-VascularDiseaseJun2O05.VoI5.No3?论着?葛根素抑制凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖许轶洲,李佩璋,王宁夫,吴欣,凌峰,张邢炜(杭州市第一人民医院心内科,浙江杭州 310006)摘要目的观察葛根素对 T 诱导的血管平滑肌细胞 (V(.Mc)增殖的影响.方法建立凝血酶(T)诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖模型,以细胞计数法和流式细胞仪 DNA 含量测定的方法观察 T 及葛根素对 VSMC增殖和 DNA 合成的影响.结果 T 对 VSMC 有明显促增殖作用
2、 ,促增殖效应在 24小时末达峰,且 T 浓度在0.1u/L 一 1.0U/L 之间有剂量依赖关系;葛根素呈剂量依赖性地抑制 T 诱导的细胞增殖与 DNA 合成.结论葛根素能抑制 T 诱导的 VSMC 增殖.关键词 葛根素 ;ifll 管平滑肌细胞;增殖;大鼠中图分类号:tL072 文献标识码:A 文章编号:1009-816X(2(X)5)03.0004-03PuetmsI 即 ThrombinImtueedProliferationofVascularSmoothMllsdeCells.删一.Lou,LIPd 一姗,WANGNing 一,et.logy,fsHospitalof 础 u,慨
3、310006,Ch/naAbstractObjectiveToo3servetheeffectofpuerarinonpmlifemfionofvascularsmoothmusclecells(VSMC)inducedbythrombin(T)inrats.MethodsCellnumberandcellcycleanalysisusingflowcometrywcrcadoptedastwodifferentindi-catovsofproliferationofVSMC.ResultsTcansignificantlyincreasecellnumberofVSMCwiththepeaI
4、【ofproliferationat24h.TheeffectofTisinadosedependentInaniler(0.1U/L 一 1.0U/L).Puerarin1.5Xlffmol/L 一 1.5X10 一 mol/LsignificantlysuppressesthesdmuladonpmlifemdonofVSMCandDNAsynthesisinducedbyT.Co-oilsPuerarincansuppresstheproliferationandDNAsynthesisofVSMCinducedbyT.KeywordsPuerarin;Vascularsmoothmus
5、clecells;ProliferationRats血管平滑肌细胞(VSMC)增殖在动脉粥样硬化,高血压等多种心血管疾病的发生发展过程中起关键作用【1.凝血酶(T) 是一种强的促有丝分裂物质2 】.葛根素(Puerarin)是从豆科植物野葛干燥根中提取的一种异黄酮类化合物,具有降血脂,抗动脉硬化等作用.本实验以葛根素作为干预因素观察其对 T 诱导的 VSMC 增殖的影响,探讨其可能存在的抑制 VSMC 增殖的机制,从而为葛根素的临床应用和深入开发提供实验依据.1 资料和方法I.I 主要试剂:DMEM 培养液和胎牛血清(FBS)(Gibco 公司产品),凝血酶(si 公司产品,批号B55687)
6、,葛根素注射液(由浙江康恩贝集团提供,批号 030502).I.2VSMC 体外培养及鉴定:组织贴块法培养收稿日期:2oo5.3-31作者简介;许轶洲(1972_),女,主治医师,从事心内科工作.VSMC.无菌条件下分离 SD 大鼠(150250g,购自浙江大学医学院实验动物中心)胸主动脉,剪碎后加入含 10%FBS 的 DMEM 培养液,37oC,5%co2孵箱内静置培养.实验用 49 代细胞.用光镜和免疫组化方法进行鉴定.I.3 细胞计数 :49 代 VSMC 以os/:fL 的密度种于 6 孔培养板,培养至 70%汇合,换成 0.5%NBS+DMEM 静息 48 小时,以不同剂量的 T
7、刺激 24小时,或 IU/mL 的 T 刺激不同时间 ,或 lu/mL 的T 和不同浓度的葛根素刺激 24 小时,然后将各孔细胞消化,再悬浮成为单细胞悬液,置细胞计数板内计数,每孔重复 3 次求平均值.I.4 流式细胞仪细胞周期分析:在上述各处理因素作用 24 小时末,制成单细胞悬液,预冷 PBS 漂洗 2 次,2O0 目滤网过滤,70%冷乙醇固定 424小时.加 Rnase(mg/n)100ul/管,3710 分钟,再加入 PI(碘化丙啶)染液(50ug/m1)800ul/管,置4,反应 3O 分钟以上.上流式细胞仪,每个样本检测 10000 个细胞,用计算机求细胞周期各时相心脑血管病防治)
8、2005 年 6 月第 5 卷第 3 期分布比率,最后求得增殖指数 PI=s+(G2/M)/【(Go/G1)+S+(G2/M).1.5 统计方法:所有实验重复 3 次,数据以均数4-标准差表示,以 spssl0.0 软件进行统计分析,假设检验采用单因素方差分析,PO.05 为具有显着差异.2 结果2.1 凝血酶对 VSMC 增殖的影响:2.1.1 凝血酶与 VSMCs 增殖的量效关系 :不同浓度 T 培养 24h,VSMCs 细胞计数不同.与对照组相比,以 0.1U/L,0.3U/L,1.0U/L,3.0U/L 及 10U/L 的 T 处理 VSMC24 小时 ,VSMC 细胞计数分别增加了(
9、2o.54-2.76)%,(59.28 7.12)%,(119.124-9.02)%,(84.284-6.63)%及 (33.064-4.18)%(P0.05).其中 T 浓度在 0.1U/L1.0U/L 之间有剂量依赖关系(表 1).表 1 不同凝血酶浓度 24h 对 VSMCs 增殖的影响细胞计数(104/m1)4.080.054.820.116.370.098.784-0.087.370.0r75.280.12注:与对照组比较,P0.052.1.2 刺激 VSMC 增殖与时相的关系:采用 1U/L的 T 刺激 VSMC048h,进行细胞计数.实验组结果与对照组比较,各时间段均有明显促增殖
10、作用(PO.05),24h 时细胞计数达到峰值(表 2).表 2 凝血酶 1U/L 促 VSMC 增殖的时相关系细胞计数(104/m1)对照组凝血酶组注:与对照组比较,P0.05根据上述结果,确定凝血酶诱导 VSMC 增殖的模型,选用 T 的浓度为 1U/L,作用时间为 24 小时.2.2 葛根素对诱导的 VSMC 增殖的抑制作用:?5?2.2.1 葛根素对 VSMC 细胞数量的影响:与对照组相比 T 引起了(118.634-9.78)%的细胞计数增加(P0.o5),这种增殖作用在被各浓度的葛根素预处理 lh 后显着地抑制(P0.o5),与 T 组相比,在葛根素浓度分别为 1.510mol/L
11、,1.510I4mol/L 及 1.510-3mol/L 时,抑制率分别为(1O.994-1.68)%,(32.174-3.34)%及(42.604-5.29)%(PO.05).2.2.2 葛根素对 VSMC 的 DNA 含量的影响:经流式细胞仪细胞周期分析,检测 DNA 含量,测定增殖指数 PI.与对照组相比,T 引起了(285.334-17.89)%的 DNA 含量的增加 (P0.05),但这种促 DNA 复制合成的作用能被各浓度的葛根素所抑制.与 T 组相比,在葛根素浓度分别为 1.510mol/L,1.510 一 mol/L 及 1.510mol/L时,抑制率分别为(22.864-3.
12、21)%,(32.214-5.72)%及(58.184-7.92)%(P0.05).葛根素的抑制作用呈剂量依赖关系.3 讨论VSMC 的异常增殖在高血压,AS 及 FlEA 术后再狭窄1 的形成中具有重要的作用.许多促VSMC 增殖的因子,如儿茶酚胺,血管紧张素,内皮素等可通过其促 VSMC 增殖的效应而引起上述病变的形成.凝血酶在血管机械性受损的急性期可出现并在整个血管损伤的形成过程中持续高表达2l.是这一过程的一个重要介质.凝血酶除了具有直接促进凝血,在动脉损伤后血管壁血栓形成中起重要作用外,还有许多其他细胞效应.例如,T 可影响血管内皮细胞功能,尤其对 VSMC 的生长起词节作用3;T
13、尚能调节其他生长因子的表达引 .本研究结果显示 T 明显促进细胞数的增加,并且凝血酶浓度在 0.1U/L 一 1.0U/L 之间有剂量依赖性,更高浓度时则量效关系不明显.有研究表明 T 是通过使凝血酶受体活化而刺激体外培养的 VSMC 增殖的 L5J,可能当 T 浓度在 1.0U/L时已达到受体饱和,因而更高的浓度则不能进一步刺激 VSMC 的增殖.这与 SchiefferB 等 L6J 的实验结果一致.本实验中 T 的促增殖作用在 24h 时达峰值,此后时间虽有所回落,但与对照组相比仍有显着的促增殖作用.这提示 T 具有后发的迟缓的促细胞增殖作用.其他研究发现,T 可诱导VSMC 自分泌碱性
14、成纤维细胞生长因子(bF) 和LLLLJ一对 ?6?堕塑鱼!堕煎堕 0f 堕 l9cuk“Di 垃 seJun2005.Vol5.No3血小板源生长因子一 A 链(PDGFA),其分泌高峰在 T 刺激 6h 以后,用抗 bFGF 抗体或抗 PDGFA 抗体均可减少 T 的促 VSMC 增殖效应.因此推测 T 的促细胞增殖作用可能部分是与其诱导 bFGF 和 PDGFA 的自分泌有关.葛根素有效成分为 4,7 一二羟基 8 一(;-D 葡萄糖异黄酮,具有扩张血管,改善微循环作用,并能降低血浆中几茶酚胺及内皮素的含量;调节一氧化氮合酶(NOS)活性,升高体内 NO 水平88.这些研究提示葛根素对心
15、脑血管具有效益的作用,但机制未明.王绿娅等研究发现葛根素在诱导兔VSMC 凋亡的过程中上调了葡萄糖调节蛋白 94基因的表达.除可诱导 VSMC 凋亡外,韩静10 等发现葛根素可抑制入脐动脉 VSMC 的增殖,在 0.125umol/L 时有剂量依赖关系.本实验发现 1.5X10mol/L1.5X10I3mol/L 的葛根素可抑制 T诱导的大鼠主动脉 VSMC 的增殖,并具有量效关系,与韩静等的研究结果基本一致,但葛根素有效浓度范围存在差异,可能是由于细胞增殖模型,处理因素作用时间等的不同所造成的.本研究结果显示,葛根素具有抑制 VSMC 增殖的作用且与浓度成正比,这提示了葛根素能在冠状动脉粥样
16、硬化,PIA 后再狭窄等的治疗中发挥一定的作用.但这种抑增殖作用的机制,还有待继续深入地研究.参考文献1RutherfordC,MartinW,SalameM,eta1.Substantialinhibitionof/leointimalresponsetoballoonuIyintheTalcadarteryu8il1gacombinantofantibodiedtOphtdetderivedSwwthfactorBBandbasicfibroblastgrowthfactor.Athermderosis,1997,130(12);4551.【2jnattOtlMW,MoarSL,Richa
17、rdsonM.DeendotheialiZatloninvivoinitiatesatIl mbccIattherabbitaortatface:correlationofuptakeoffibdnogenandantithrombinll1withth_nxnbingenerationbytheexpomdxmdothelimn.AmJPathol,1989,135:499508.【3jNelkenNA,SofterSJ,OKJ,eta1.ThrmnbinreeeptoFempremioninnoItllidandatherosclerotichumanarteries.JClinInves
18、t,l992,9o(4):16141662.4Kall 出C,ParryG,wlijela 出 E,eta1.-I1mm.mir 山 o.dpr0lif.帆 and 目ofplatdetderivedfactoracl18irIgtleinhumanva.ularsmoothrrmsclecel1.FEBSLeft,1992,314:143148.【5jMcNamaraCA,SarembockIJ,GimpleLW,eta1.Thmmbinstimu.1aresproliferationofculturedrataitlcsmoothmusclecellsbyaprote.olyticalya
19、ctivatedreeept.JClinInvest,1993,91:9498.6SchiefferB,Drex1erH,UngBN,eta1.Gproteincupledrecep-tomcontrolvcuIarsmoothnmsdecellproliferationviapp60一舡 candp2lras.AmJPhysiol,1997,272(6Pt1):20192030.【7jCucinaA,BorrelliV,DiCarloA,eta1.Tlmmininduce8produc.tionof 乎 uwIllfactolfixnaorticsmoothmusclecells.JSurg
20、Res,1999,82(1):6166.8高鹏,夏成青 ,王佩燕,等.葛根素对全脑缺血再灌流后脑组织诱导型一氧化氮合酶影响的实验观察.中华急诊医学杂志,2001,10(2):8586.9王绿娅,刘舒 ,王伟,等.葛根素能诱导血管平滑肌细胞凋亡部分相关基因差异表达.中国动脉硬化杂志,20O2,10(6):487490.1O韩静,王伟 .葛根素与大豆苷元对血管平滑肌细胞的抑制作用.中国中药杂志,2OO4,29(5):437 44O.心脑血管病相关新书介绍O05 先天性心脏病介入治疗孔祥清江苏科学技术出版社 78 元与其他心血管病介入诊断和治疗一样,作为介入心脏病学分支之一的先天性心脏病的介入诊断与
21、治疗也正在飞速发展,以致很多心血管病介入医师迄今不甚了解不断出现的新概念和新技术.先天性心脏病的介入诊断主要是评价先天性心脏病病人的心脏,血管畸形和心脏功能状态,为病人选择最佳的治疗时机和最好的治疗方法提供依据,同时随访和追踪经过治疗006 循证心血管医学? 概念和证据评价分册胡大一人民军医出版社 1O 元本书对循证的概念和证据评价进行了由浅入深和全面地叙述.书中重点将证据的确立及在此基础上对心血管疾病病史及体格检查的严格评估,诊断过程中的信息采集,最佳证据的寻找和对心血管临床实践进行了评估等作了系统阐述,并对生活质量概念理解,卫生经济学相关概念认识,决策分析法的最新理论进行了介绍.其内容充实,科学性强.f 以上书籍各地新华书店有售,本刊躺辑部可代为邮购,骨注明躺号并付 5 元包费)
